Download Đề tài Thiết lập qui trình Southern Blot miễn phí
Phần 1.
MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trong những năm gần đây, trên thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự chuyển hướng rõ rệt cho thế kỷ 21. Trước hết là những đầu tư rất lớn để khai thác và ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh, sâu hại, cỏ dại và các loại côn trùng gây hại trong sản xuất nông nghiệp. Đây là một hướng nghiên cứu mới có thể trở thành một công nghệ sạch trong phòng trừ sâu bệnh hại ở nước ta nếu được đầu tư phát triển sản xuất. Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học, theo đó các kĩ thuật về sinh học phân tử đã ra đời như phương pháp Southern blot, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), STS (Sequence Tagged Site), PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RADP (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), SNP (Single Nucleotide Polymorphism) tạo nên một sự chuyển biến mới trong các hướng nghiên cứu về acid nucleic. Đặc biệt là các nghiên cứu sâu về gen và cấu trúc gen. Trong đó, phương pháp Southern blot được xem là một kĩ thuật đem lại kết quả chính xác cao và có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử. Một trong những ứng dụng quan trọng của Southern blot là lập bản đồ giới hạn di truyền; phát hiện các khuyết tật về di truyền do gen; chẩn đoán phân tử; xác định số bản sao của gen. Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát triển và hoàn thiện phương pháp. Với những trang thiết bị hiện có của Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP. HCM, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Thiết lập qui trình Southern blot ”.
1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu đề tài Thiết lập qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong điều kiện phòng thí nghiệm.
1.2.2 Yêu cầu - Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt genomic DNA bằng các enzyme giới hạn. - Tạo được phân tử probe đánh dấu từ sản phẩm PCR. - Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray.
/tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-2237/
++ Ai muốn tải bản DOC Đầy Đủ thì Trả lời bài viết này, mình sẽ gửi Link download cho!Tóm tắt nội dung:
1
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1ĐẶT VẤN ĐỀ
Với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trong những năm gần đây, trên
thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự
chuyển hướng rõ rệt cho thế kỷ 21. Trước hết là những đầu tư rất lớn để khai thác và
ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh, sâu hại, cỏ dại và các
loại côn trùng gây hại trong sản xuất nông nghiệp. Đây là một hướng nghiên cứu mới
có thể trở thành một công nghệ sạch trong phòng trừ sâu bệnh hại ở nước ta nếu được
đầu tư phát triển sản xuất.
Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học, theo đó các kĩ thuật về
sinh học phân tử đã ra đời như phương pháp Southern blot, RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism), STS (Sequence Tagged Site), PCR (Polymerase
Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RADP
(Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), SNP
(Single Nucleotide Polymorphism) tạo nên một sự chuyển biến mới trong các hướng
nghiên cứu về acid nucleic. Đặc biệt là các nghiên cứu sâu về gen và cấu trúc gen.
Trong đó, phương pháp Southern blot được xem là một kĩ thuật đem lại kết quả chính
xác cao và có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử. Một trong những ứng dụng quan
trọng của Southern blot là lập bản đồ giới hạn di truyền; phát hiện các khuyết tật về di
truyền do gen; chẩn đoán phân tử; xác định số bản sao của gen.
Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh
Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự
Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát
triển và hoàn thiện phương pháp. Với những trang thiết bị hiện có của Trung Tâm
Phân Tích Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP. HCM, chúng tui đã thực hiện đề tài
“Thiết lập qui trình Southern blot ”.
1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1 Mục tiêu đề tài
Thiết lập qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2
1.2.2 Yêu cầu
- Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt genomic DNA bằng các enzyme giới hạn.
- Tạo được phân tử probe đánh dấu từ sản phẩm PCR.
- Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray.
3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
Southern blot, một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu trúc của gene, được
phát triển vào giữa thập niên 1970 do Ed Southern ở MRC một bộ phận của genome
động vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975). Đã gần 30 năm trôi qua, kĩ thuật lai
Southern đã được cải tiến đi rất mhiều, chủ yếu bao gồm:
- Tăng độ nhạy
- Giảm một số bước trong quá trình lai
- Giảm thời gian thực hiện
- Về kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn trước nhiều.
Theo đó, một số phương pháp chuyển lên màng cũng đã được mô tả bởi các tác giả
sau: Southern (1979); Maniatis và ctv (1982); Meinkoth và Wahl (1984); Vandenplas
và ctv (1984); Jeffreys và ctv (1985) nhưng đều dựa trên một nền tảng chung:
- DNA được giữ trong một hệ thống gel thích hợp
- DNA được vận chuyển lên một giá thể rắn
- Probe đánh dấu được lai với DNA được giữ trên một vật thể và probe có
thể được loại bỏ sau quá trình lai
- Sản phẩm lai được phát hiện dựa trên một hệ thống phát hiện thích hợp.
Song song đó, nhiều phương pháp chuyển DNA từ gel lên màng cũng được thực
hiện như: blot mao dẫn hướng xuống (Lichtenstein và ctv, 1990; Chomozynki, 1992),
blot chân không (Medveczky và ctv,1987; Olszewska và Jone, 1988; Trnovsky, 1992),
blot hai chiều (Sambrook và Russell, 1999), và blot với đệm alkaline (Reed và Mann,
1985).
Bên cạnh đó, vật liệu làm màng cũng đã được cải tiến đi rất nhiều. Phương pháp
Southern blot đầu tiên được mô tả bởi Southern sử dụng màng nitrocellulose để
chuyển DNA. Trong vài năm lại đây, vật liệu màng mới được phát triển và bao gồm
giấy DBM, DPT và cả hai loại màng nylon tích điện và không tích điện, với mục đích
tăng độ liên kết, có thể vận chuyển những phân tử nhỏ, và màng có thể sử dụng lại cho
việc lai sau khi đã loại bỏ probe.
4
Cùng với sự phát triển đó, các phương pháp đánh dấu probe không dùng phóng xạ
đã ra đời và đang được thương mại hóa trên thị trường. Bằng việc sử dụng các tiểu
phần của biotin (Langer và ctv, 1981) và dùng enzyme gắn kết với DNA probe (Renz
và Kurz, 1984). Năm 1990, Ishii thuộc Viện Lúa Quốc tế đề nghị cải tiến phương pháp
Southern blot không dùng đồng vị phóng xạ, bằng cách sử dụng digoxigenin. Các phân
tử lai được phát hiện bằng kháng thể của digoxigenin có gắn với enzym photphatase
kiềm. Probe sử dụng có thể là DNA, RNA, cDNA.
2.2 NGUYÊN TẮC CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
Đầu tiên cần tách chiết DNA bộ gen của tế bào, sử dụng các enzyme giới hạn cắt
phân tử DNA thành các đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách các đoạn DNA theo
kích thước. Gây biến tính DNA trên gel bằng dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5
M; NaCl 1,5 M), sau đó chuyển các đoạn DNA từ bản gel lên màng lai bằng lực mao
dẫn (màng lai thường sử dụng là màng nitrocellulose). Vị trí của các đoạn DNA trên
gel, được giữ yên khi chuyển lên màng lai.
Sử dụng các phân tử probe có đánh dấu phóng xạ lai với các đoạn DNA trên màng
lai, tạo nên các phân tử DNA lai. Tiến hành lai phân tử bằng cách cho vào hộp lai
chuyên dụng một lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai, chứa mồi có đánh dấu phóng xạ.
Đặt màng lai vào hộp lai ở nhiệt độ 65oC trong 3 – 8 giờ, sau đó thêm dịch lai với chế
độ nhiệt 65oC, lắc nhẹ để tăng tốc độ phản ứng. Rửa màng lai bằng dung dịch SSC
(NaCl, natri citrat, và nước) ở nhiệt độ 65oC hai đến ba lần, thấm khô bằng giấy lọc
hay sấy khô ở 65oC.
Thực hiện phóng xạ tự ghi bằng phim X quang nhạy ở nhiệt độ - 20oC, xử lý dưới
ánh sáng tử ngoại trong 4 giây để kiểm tra kết quả lai.
2.3 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
Việc khám phá ra sự tương đồng của các chuỗi DNA thông qua phương pháp
Southern blot đã góp một vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử
và tái tổ hợp DNA. Southern blot là một phương pháp quan trọng để nghiên cứu những
vấn đề cơ bản như sự hiểu biết về cấu trúc gen, biểu hiện của gen và các genome.
Lai Southern blot được áp dụng để phát hiện số lượng bản sao của một gen trong
genome, sự thay đổi trật tự sắp xếp của các đoạn DNA, sự có mặt của các đoạn DNA
5
lạ, sự thay đổi vị trí của các transposon, phân biệt một gen trong họ gen, xác định các
intron, exon của một gen …. Khi áp dụng các chỉ thị phân tử (marker DNA) khác nhau
làm mồi, chúng ta có thể phân biệt được các loài, cá thể dưới loài. Phương pháp
Southern blot càng có vai trò trong chẩn đoán các bệnh do di truyền và những khám
phá về vi khuẩn cũng như các chủng vi rút gây bệnh (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 2001).
2.4 SỰ KHÁC NHAU GIỮA SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT VÀ
WESTERN BLOT
Bảng 2.1 Những điểm khác nhau cơ bản giữa Southern blot,
Northern blot và Western blot
Southern blot Northern blot Western blot
1) Chiết xuấ...
