Download miễn phí Luận văn Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của người trong vi khuẩn Echerichia Coli



MỤC LỤC
Trang
Bảng viết tắt . 1
Danh mục các hình . 2
Mở đầu . 3
Chương 1: Tổng quan tài liệu . 5
1.1. Bệnh tim mạch . 5
1.2. Chất hoạt hóa plasminogen. 5
1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô người . 9
1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu đông . 12
1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô người . 14
1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam . 18
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu . 19
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị . 19
2.1.1. Vật liệu . 19
2.1.2. Hóa chất . 20
2.1.3. Thiết bị . 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 20
2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose . 20
2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide . 21
2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) . 22
2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế . 23
2.2.5. Ghép nối DNA . 23
2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt . 24
2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli . 24
2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli . 24
2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid . 25
2.2.8. Xác định trình tự gen . 26
2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli . 27
Chương 3: Kết quả và thảo luận . 28
3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA. 28
3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR . 28
3.1.2. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) . 30
3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế . 30
3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế . 31
3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) . 32
3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hóa h-tPA . 32
3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt . 32
3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA . 33
3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hóa h-tPA . 37
3.2. Biểu hiện gen . 43
3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp . 43
3.2.2. Kiểm tra protein bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE . 43
Kết luận và đề nghị . 47
Tài liệu tham khảo . 48
Phụ lục . 5


http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-10-26-luan_van_nghien_cuu_bieu_hien_gen_ma_hoa_chat_hoat.HXUpa1zcio.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-42417/
Để tải bản DOC Đầy Đủ xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung:

iêng biệt
chúng theo khả năng di động trong trường điện từ về hai cực âm (-) và dương (+).
Kết quả nhận được phổ các vạch protein khác nhau. Phương pháp điện di là một
phương pháp nghiên cứu sinh hóa thông dụng và rất tiện lợi. Phương pháp điện di
protein thường được tiến hành trên chất mang ở dạng gel là lưới polymer. Lưới
polymer làm chậm tốc độ di chuyển các phân tử protein theo khối lượng, kích
thước, độ mang điện của chúng.
Phương pháp điện di protein trên gen polyacrylamit có chứa SDS được tiến
hành theo phương pháp của Laemmli [29]. Thành phần gel được trình bày ở Bảng
11 phần Phụ lục. Quy trình điện di như sau:
- Pha mẫu với Protein Sample Buffer 4X và biến tính mẫu ở 95oC trong 5
phút. Dùng 10 l mẫu tra vào từng giếng và tiến hành điện di trên gel
polyacrylamide 10% gồm gel cô 4% và gen tách 10%.
- Đổ dung dịch chạy (Running buffer) SDS- Page 1x và chạy điện di: Chạy
ở hiệu điện thế 110V trong 2- 3 giờ. Theo dõi đến khi thấy màu dung dịch đệm mẫu
bắt đầu thoát ra ngoài dung dịch đệm chạy thì kết thúc.
- Bản gel được nhuộm trong dung dịch nhuộm (Comasive Brilliant Blue
R250) trong khoảng từ 30 phút đến 1 giờ.
- Tẩy gel bằng cách ngâm bản gel đã nhuộm vào dung dịch tẩy (acid acetic
7%, metanol 20%) đến khi bản gel màu trắng thì kết thúc quá trình tẩy. Thời gian
tẩy khoảng 30 phút. Sau đó gel được bảo quản và chụp ảnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22
2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction-
PCR)
Phương pháp PCR nhằm mục đích khuyếch đại in vitro một đoạn DNA khi
biết trình tự hai đầu. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là nhờ sự xúc tác của enzyme
DNA polymerase chịu nhiệt để khuyếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in
vitro trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu [48].
Trong nghiên cứu này, chúng tui đã sử dụng 2 cặp mồi là Cặp 1: h-tPA-NdeI
F2, h-tPA-XhoI R3; Cặp 2: h-tPA-BamHI F2, h-tPA-XhoI R4.
Các thành phần của PCR: đoạn DNA khuôn (cDNA mã hóa h-tPA được tạo
dòng trong vector pUC18), hai cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15- 30 nucleotide, bốn
loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), DNA polymerase.
PCR bao gồm các giai đoạn:
– Giai đoạn biến tính: DNA được biến tính ở nhiệt độ khoảng 94oC- 95oC trong thời
gian một vài phút, khi đó các liên kết hydro bị đứt và sợi DNA dạng sợi kép thành
hai sợi đơn;
– Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ từ 40oC- 65oC trong khoảng 30 giây đến 1 phút,
hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ bắt cặp với sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở
hai đầu đoạn DNA cần nhân. Nhiệt độ của bước gắn mồi tùy thuộc vào từng loại
mồi cụ thể, được tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi;
– Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ phản ứng được nâng lên 70oC- 80oC (trung bình
khoảng 720C) trong khoảng thời gian thích hợp (tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần
tổng hợp), enzyme Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp DNA diễn ra;
Quy trình phản ứng được thực hiện trên máy PCR GeneAmp PCR System
9700 với thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 5 phần Phụ lục, chu trình
nhiệt phản ứng như sau:
Chu trình nhiệt trên máy GenAmp PCR System 9700 như sau:
94
o
C 94
o
C 60
o
C 72
o
C 72
o
C 4
o
C
3’ 30’’ 30’’ 1’30’’ x30ck 10’ 
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose
0,8%, sau đó được tinh sạch DNA theo kit Wizard SV Gel and Clean-Up System.
2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế
Nguyên tắc: Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết
các đoạn DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt
cả hai sợi của phân tử DNA. Enzyme hạn chế cắt DNA hình thành hai dạng đầu: tạo
đầu bằng và tạo đầu dính.
Đối với sản phẩm PCR chúng tui tiến hành cắt bằng hai cặp enzyme
BamHI/XhoI và NdeI/XhoI. Vector pET21a(+) được xử lý bằng NdeI/XhoI và
pGEX6p1 được cắt bằng BamHI/XhoI. Thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng
6 phần Phụ lục. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích
hợp (thường ở 370C, 2 giờ). Sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 0,8%;
Sau khi cắt bằng enzyme hạn chế, các vector được xử lý với phosphatase để
loại nhóm phosphate ra khỏi đầu 5’ nhằm giảm quá trình nối lại của vector. Thành
phần phản ứng được trình bày ở Bảng 7 phần Phụ lục. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong
1h sau đó tiếp tục ủ ở 75oC trong 15 phút để loại CIP [48].
2.2.5. Ghép nối DNA
Nguyên tắc: Đoạn cDNA và vector được xử lý bằng cùng một loại enzyme
hạn chế tạo đầu bổ sung, các đầu này có trình tự bắt cặp với nhau. Dưới tác dụng của
enzyme T4 DNA ligase, đoạn DNA quan tâm sẽ được gắn vào vector. Thành phần
phản ứng ghép nối được trình bày ở Bảng 8 Phần Phụ lục.
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và ủ 14- 24 giờ, ở 16oC. Sản phẩm phản ứng
được biến nạp vào E. coli và chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung Ampicillin
(Amp), nồng độ 50µg/ml [48].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24
2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng
pháp sốc nhiệt
Tùy từng mục đích khác nhau mà chúng tui chuẩn bị các chủng vi khuẩn
khác nhau. Chủng tế bào dùng tạo dòng là vi khuẩn E. coli chủng DH5α. Để biểu
hiện, chúng tui sử dụng vi khuẩn E. coli chủng BL21. Quy trình chuẩn bị và biến
nạp đối với hai chủng là tương tự nhau [48].
2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli
- Chủng vi khuẩn lấy từ ống giữ chủng được cấy ria trên môi trường LB đặc và
nuôi qua đêm ở 37oC; Ngày hôm sau lấy 1 khuẩn lạc rời từ đĩa cấy ria, nuôi lắc
200vòng/phút (v/p) ở 37oC trong môi trường LB lỏng từ 1- 2h; Ngày tiếp theo cấy
trải dịch nuôi ra đĩa chứa môi trường LB đặc. Nuôi qua đêm ở 37oC;
- Chọn 1 khuẩn lạc từ đĩa, cấy chuyển vào 1,5 ml môi trường LB lỏng, nuôi
qua đêm ở 37oC;
- Cấy chuyển 200l dịch nuôi sang 30 ml LB lỏng. Nuôi lắc trong 3h ở 37oC;
- Chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm. Giữ lạnh trên đá trong 10 phút;
- Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút, ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi; sau đó bổ sung 15 ml
dung dịch CaCl2 0,1M. Làm tan hết tủa tế bào trong dung dịch CaCl2. Ủ trên đá
trong 40 phút;
- Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi; bổ sung 1,5 ml dung
dịch CaCl2 0,1 M. Ly tâm nhẹ để hòa tan tủa tế bào vào dung dịch CaCl2;
- Chia ra các ống eppendorf và bổ sung 20 l glycerol 100%. Búng nhẹ để trộn
đều các thành phần với nhau (thao tác trong box). Giữ tế bào khả biến ở -80oC [48].
2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli
- Tế bào khả biến E. coli được giữ trên đá khoảng 30 phút, sau đó bổ sung 5l
của sản phẩm ghép nối vào ống tế bào khả biến (khoảng 100l). Giữ trong đá
khoảng 15 phút;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 70 giây, sau đó chuyển ngay sang bình đá và giữ
trong đá 5 phút;
- Bổ sung 300l môi trường LB lỏng;
- Nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1giờ;
- Cấy trải hết dịch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung Amp
(50g/ml), nuôi ở 37oC qua

---