Download miễn phí Luận văn Xác định sự hoạt hóa của Phosphatidylinositol 4-Phosphate 5-kinase (PIP5K) A và C61 trên dòng tế bào HeLa chuyển gene
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC . i
DANH MỤC CHỮVIẾT TẮT . v
DANH MỤC CÁC BẢNG . vii
DANH MỤC CÁC HÌNH . viii
LỜI MỞ ĐẦU . 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phosphatidylinositol 4 phosphate 5 kinase (PIP5K). . 2
1.1.1. Cấu trúc của PIP5K. . 2
1.1.2. Quá trình tổng hợp PIP2 của PIP5K trong tếbào. . 3
1.1.3. Protein PIP5KA. . 5
1.1.4. Protein PIP5KB . 6
1.1.5. Protein PIP5KC . 7
1.1.6. Các nhân tốhoạt hóa PIP5K . 8
1.2. Protein kinesin KIF2A . 9
1.2.1. Họprotein kinesin (KIFs) . 9
1.2.2. Protein KIF2A . 11
1.3. Phức hợp adaptor protein AP-2 . 12
1.3.1. Cấu trúc của protein AP-2 . 12
1.3.2. AP-2 là protein tương tác đặc hiệu với PIP5KC661. . 13
1.4. Hệthống bổtrợhuỳnh quang hai phân tửSplit Venus. . 15
1.4.1. Hệthống bổtrợhuỳnh quang hai phân tử(Bimolecular Fluorescence
Complementation – BiFC). . 15
1.4.2. Hệthống Split Venus . 16
Mục tiêu và nội dung thực hiện . 17
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1.VẬT LIỆU . 18
2.1.1.Dụng cụ- Thiết bị. 18
2.1.1.1.Dụng cụ. 18
2.1.1.2.Thiết bị. 18
2.1.2.Hóa chất – Môi trường . 18
2.1.2.1.Hóa chất . 18
2.1.2.2.Môi trường . 21
2.1.3.Nguyên vật liệu . 22
2.1.3.1.Tếbào . 22
2.1.3.2.Chủng vi sinh vật. 22
2.1.3.3. Các plasmid sửdụng trong luận văn . 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP . 24
2.2.1. Phương pháp thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng PCR . 24
2.2.1.1. Đặc điểm cặp mồi sửdụng trong phản ứng PCR . 24
2.2.1.2. Phản ứng PCR . 25
2.2.2.Tạo dòng trình tựmã hóa vùng hình cầu của protein KIF2A. . 26
2.2.2.1.Xửlý sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD và plasmid pVenus-N1
bằng enzyme XhoIvà EcoRI. 26
2.2.2.2.Tinh sạch sản phẩm cắt bằng bộkit gel M . 27
2.2.2.3.Thiết lập phản ứng nối tạo vector tái tổhợp. . 28
2.2.2.4.Biến nạp sản phẩm nối vào tếbào vi khuẩn E.coliDH5α. . 28
2.2.2.5. Thu nhận dòng tếbào E.coli mang plasmid tái tổhợp pVenus-KIF2A-GD . 29
2.2.3. Tạo dòng trình tựmã hóa vùng ear của protein β2-Adaptin-ear . 31
2.2.4. Tách chiết lượng lớn plasmid tái tổhợp bằng bộkit Midiprep (Quiagen) . 31
2.2.5. Phương pháp nuôi cấy tếbào động vật. . 32
2.2.5.1. Phương pháp cấy chuyền tếbào. . 32
2.2.5.2. Bảo quản tếbào nuôi cấy . 33
2.2.6. Kiểm tra sựbiểu hiện protein KIF2A-GD và protein β2-Adaptin-ear. . 34
2.2.6.1. Phương pháp chuyển DNA vào tếbào động vật bằng
Lipofectamine . 34
2.2.6.2. Phát hiện PIP5KA và PIP5KC661 hoạt hóa invitrobằng phương pháp
kính hiển vi huỳnh quang. . 37
2.2.6.3. Xác định tỉlệtếbào phát huỳnh quang. . 37
2.2.6.4. Kiểm tra sựtái sắp xếp của actin trong tếbào . 37
2.2.6.5. Xác định cường độtín hiệu huỳnh quang bằng phần mềm Image J
Basics (NIH). . 38
Chương 3: KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo dòng và kiểm tra trình tựcDNA vùng hình cầu của protein KIF2A
(KIF2A-GD) và vùng ear của protein β2-Adaptin (β2-Adaptin-ear) . 39
3.1.1. Thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng phương pháp
PCR. . 39
3.1.2. Dòng hóa cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear vào vector pVenus
(1-173) N1 và pVenus (155-238) N1. . 40
3.1.3. Kết quảgiải trình tự. 42
3.2. Kiểm tra sựbiểu hiện của các protein và hiệu quảhoạt động của hệthống
Split Venus. . 46
3.2.1. Kết quảkiểm tra sựbiểu hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang. . 46
3.2.2. Kết quảxác định hiệu quảbiểu hiện của các cặp plasmid . 50
3.3. Xác định sựhoạt hóa của PIP5KA và PIP5KC661 trên dòng tếbào HeLa clone 3. . 51
3.3.1. Kết quảbiến đổi kiểu hình của tếbào HeLa clone 3 khi được kích thích
bởi nhân tốtăng trưởng biểu mô EGF. . 52
3.3.2. Kết quảbiến đổi kiểu hình của tếbào HeLa clone 3 khi protein ARF6 QL
biểu hiện vượt mức. . 53
3.3.2. Kết quả định lượng cường độhuỳnh quang trên dòng tếbào HeLa clone 3 . 55
Chương 4: KẾT LUẬN
KẾT LUẬN . 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 59
PHỤLỤC
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-27-luan_van_xac_dinh_su_hoat_hoa_cua_phosphatidylinos.jiIwmNlfik.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52326/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Chương 1: Tổng quan tài liệu
2
1.1. Phosphatidylinositol 4 phosphate 5 kinase (PIP5K).
1.1.1. Cấu trúc của PIP5K.
PIP5K là nhóm các protein kinase, PIP5K có 3 isozyme là PIP5Kα, PIP5Kβ
và PIP5Kγ. PIP5Kα và PIP5Kβ có cùng khối lượng phân tử là 64 kDa. Hai isozyme
này được tạo dòng đồng thời ở người và chuột, danh pháp của chúng trái ngược
nhau. PIP5Kα của người tương ứng với PIP5Kβ của chuột và PIP5Kβ của người
tương đồng với PIP5Kα của chuột [5]. Riêng protein PIP5Kγ có 3 biến thể, có kích
thước và chức năng khác nhau. PIP5Kγ635 gồm 635 amino acid, PIP5Kγ661 có
thêm 26 amino acid ở đầu C và PIP5Kγ687 có thêm 26 amino acid chèn vào trước
trình tự 26 amino acid của PIP5Kγ661 [24].
PIP5K gồm vùng lõi kinase bảo tồn, tương đồng khoảng 80 % giữa các
isozyme. Vùng kinase này có một motif cần thiết cho sự liên kết với màng tế bào.
Vùng COOH- và NH2- khác nhau giữa các isozyme. Hai vùng này được đoán là
vị trí tương tác của PIP5K với các protein khác. [21].
Để thuận tiện trong việc trình bày, trong khuôn khổ đề tài này, chúng tui tạm
gọi các isozyme PIP5K như sau:
Hình 1.1. Cấu trúc các isozyme của PIP5K [21]
Chương 1: Tổng quan tài liệu
3
Bảng 1.1. Tên gọi các PIP5K trong đề tài
Tên gọi trong đề tài
PIP5Kα (người) và PIP5Kβ (chuột) PIP5KA
PIP5Kβ (người) và PIP5Kα (chuột) PIP5KB
PIP5Kγ PIP5KC
PIP5K xúc tác quá trình tổng hợp phosphatidylinositol (4, 5)-biphosphate
(PIP2), là một phospholipid có nhiều chức năng quan trọng trong tế bào.
1.1.2. Quá trình tổng hợp PIP2 của PIP5K trong tế bào.
Phosphatidylinositol (4, 5) - bisphosphate (PIP2) chủ yếu tập trung ở màng tế
bào, chiếm khoảng 1 % tổng lượng phospholipid trên màng. Tuy chỉ chiếm một
lượng nhỏ nhưng PIP2 có vai trò quan trọng trong các quá trình điều hòa của tế bào.
PIP2 có vai trò như phân tử truyền tín hiệu thứ cấp trong quá trình chết theo chương
trình (apoptosis), vận chuyển qua màng tế bào… PIP2 gắn trực tiếp vào protein bám
trên actin và điều hòa hoạt động của các protein này, dẫn đến quá trình tái sắp xếp
của khung xương tế bào (hình 1.2) [38].
PIP2 được tổng hợp thông qua hai con đường. Thứ nhất, PIP5K gắn nhóm
phosphate vào phosphatidylinositol 4-phosphate PI(4)P tại vị trí D5 của vòng
inositol. Thứ hai, phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase (PIP4K) gắn nhóm
phosphate vào phosphatidylinositol 5-phosphate PI(5)P tại vị trí D4. Tuy nhiên, do
hàm lượng PI(4)P trong tế bào nhiều hơn khoảng 10 lần so với PI(5)P nên quá trình
tổng hợp PIP2 chủ yếu thông qua con đường thứ nhất (hình 1.3) [5][24].
Chương 1: Tổng quan tài liệu
4
Hình 1.3. Quá trình tổng hợp PIP2 từ PI(4)P [21]
PIP5K phosphoryl hóa phosphotidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) tại vị trí D5
[PIP2]
Hình 1.2. Vai trò của PIP5K và PIP2 trong các con đường truyền
tín hiệu của tế bào [38]
Quá trình
apoptosis Vận chuyển qua
màng tế bào
Quá trình tạo bám
dính trên tiêu điểm
(focal adhesion
assembly)
Quá trình tái
tạo sợi trục
thần kinh
(neurite
remodeling)
Quá trình thực bào
Chương 1: Tổng quan tài liệu
5
Hiện nay, vẫn chưa có bằng chứng cụ thể để giải thích tại sao PIP2 lại có
nhiều chức năng, nhưng một giả thuyết được đặt ra là do các isozyme PIP5K tham
gia quá trình tổng hợp PIP2 khác nhau ở mỗi loại tế bào [21].
1.1.3. Protein PIP5KA.
PIP5KA được tìm thấy ở nhiều thành phần của tế bào, trong nhân, màng tế
bào, bộ máy Golgi và tại những nếp gấp trên màng (membrane ruffle). PIP5KA
tham gia điều hòa các hoạt động của tế bào như sau:
• Quá trình apoptosis:
Nghiên cứu của Mejillano và cs (2001) cho thấy PIP5KA tham gia điều hòa
hoạt động của caspase, họ protein quan trọng của quá trình chết theo chương trình
(apoptosis) của tế bào. Khi PIP5KA biểu hiện vượt mức, protein này xúc tác tổng
hợp PIP2 và PIP2 trực tiếp ức chế hoạt động caspase, đặc biệt là caspase-3, dẫn đến
quá trình apoptosis của tế bào bị ngừng lại. Ngược lại, khi quá trình apoptosis xảy
ra, PIP5KA là PIP5K duy nhất bị phân cắt bởi caspase-3 (hình 1.3 A). Đây là một
quá trình điều hòa thuận nghịch để duy trì sự cân bằng giữa tăng trưởng và
apoptosis của tế bào [25].
• Quá trình nhập bào:
PIP5KA tham gia vào quá trình nhập bào thông qua thụ thể. Một đột biến
mất đoạn nhỏ trên trình tự của PIP5KA làm giảm hoạt động kinase, PIP5KA không
thể di chuyển đến màng tế bào và ức chế quá trình nhập bào qua thụ thể của nhân tố
tăng trưởng biểu mô EGFR (epidermal growth factor receptor) [24].
Trong quá trình thực bào, PIP5KA biểu hiện tại một cấu trúc đặc biệt do sự
tái sắp xếp của actin trên màng tế bào tại vị trí thực bào (gọi là phagocytosis cup),
PIP2 cũng được quan sát thấy tại đây. Khi PIP5KA bị đột biến đồng thời tại vị trí
amino acid 309, asparatate chuyển thành asparagine và đột biến tại vị trí amino acid
472, Arginine chuyển thành Glutamine (D309N/R427Q), cấu trúc phagocytosis cup
không được hình thành và PIP2 không tập trung ở vị trí này [9][36].
Chương 1: Tổng quan tài liệu
6
• Quá trình sắp xếp của khung xương tế bào:
PIP5KA còn có vai trò quan trọng trong việc điều hòa cấu trúc màng tế bào.
Sự biểu hiện vượt mức PIP5KA dẫn đến hình thành cấu trúc lamellipodia khi
protein Rac1 được hoạt hóa. Ngược lại khi protein Rac1 bị bất hoạt, PIP5KA thúc
đẩy hình thành những nếp gấp trên màng tế bào (gọi là membrane ruffle).
Trong nguyên bào sợi MG-63, PIP5KA di chuyển đến màng tế bào khi tế
bào được kích thích bởi nhân tố tăng tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu
(platelet-derived growth factor - PDGF) [24]
1.1.4. Protein PIP5KB
PIP5KB tồn tại ở dạng protein tan trong tế bào chất, liên kết với màng
plasma. Hoạt động của PIP5KB phụ thuộc vào quá trình gắn và loại nhóm
phosphate. Trong các thí nghiệm in vitro, PIP5K có thể tự gắn nhóm phosphate tại
vị trí Ser/Thr của trình tự kinase và ức chế hoạt động kinase của bản thân. Protein
kinase A phụ thuộc AMP vòng (cAMP-dependent protein kinase A) có thể gắn
nhóm phosphate và bất hoạt PIP5KB. Những tác nhân kích thích quá trình loại
nhóm phosphate của PIP5KB đã được xác định. Khi tế bào NIH 3T3 được kích
thích bởi lysophosphatidic acid (LPA) hay là 12-myristate 13-acetate (PMA),
PIP5KB được hoạt hóa và tăng biểu hiện [24].
PIP5KB cũng có những chức năng tương tự như PIP5KA do cấu trúc của hai
protein này có độ tương đồng cao.
• Tham gia quá trình sắp xếp của khung xương tế bào:
Có bằng chứng cho thấy PIP5KB đóng vai trò quan trọng trong quá trình
điều hòa hoạt động của actin. Khi được biểu hiện vượt mức trong tế bào, PIP5KB
cảm ứng quá trình polymer hóa actin. Tế bào phì (mast cell) của chuột bất hoạt gene
pip5kb tổng hợp PIP2 ít hơn 35% và actin được polymer hóa ít hơn so với bình
thường [24]. Ở tế bào COS-7 được chuyển gene mã hóa PIP5KB, cấu trúc actin
gồm những sợi ngắn, nhỏ và kết hợp lại theo dạng chùm lá thông (pine needles)
[34].
Chương 1: Tổng quan tài liệu
7
Tế bào HeLa khi được nuôi cấy trong môi trường ưu trương, chủ yếu
PIP5KB được hoạt hóa, dẫn đến quá trình tổng hợp PIP2 và biến đổi kiểu hình như
actin được polymer hóa thành những sợi dày và ngắn hơn, tập trung ở ngoại vi tế
bào [40].
• Tham gia điều hòa quá trình nhập bào:
Tro...
