Download miễn phí Tìm hiểu Phương pháp PCR



Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphim) được phát triển dựa trên nguyên lý PCR để nhân bản những đoạn ADN đã được phân cắt bởi enzym giới hạn (restriction enzyme). Điểm cơ bản nhất của kỹ thuật này đó là sự thiết kế mồi PCR đặc trưng. Qui trình thiết kế mồi PCR được tiến hành như sau trước tiên, ADN tổng số được cắt bởi các enzym giới hạn; hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng hai enzym EcoRI (enzym nhận biết 6 nucleotit) và MseI (enzym nhận biết 4 nucleotit). Khi sử lý với enzym giới hạn, ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau mà mỗi mảnh ta đều biết được trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự đã biết ở đầu cắt, ta thiết kế các đoạn gắn (adapter) và gắn chúng vào mỗi đầu. Dựa vào trình tự adapter người ta thiết kế mồi PCR, mồi gồm hai phần: một phần có trình tự nucleotide bổ sung với adapter và phần còn lại là những nucleotide đựơc thêm vào tuỳ ý, thông thường từ 1 đến 3 nucleotide. Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản. Do kết hợp được những đặc điểm của kỹ thuật RFLP và kỹ thuật RAPD nên kỹ thuật AFLP có nhiều ưu điểm như: đơn giản, ổn định, khả năng ứng dụng rộng và do có thể bổ sung các nucleotide khác nhau khi thiết kết mồi nên số lượng mồi có thể thiết kế được và tiềm năng ứng dụng rất lớn. Về cơ bản AFLP là chỉ thị trội và vị trí nhiễm sắc thể của chúng chưa xác định, do vậy nếu dùng chỉ thị này để lập bản đồ gen ở quần thể F2 thì cần sử dụng kết hợp với các chỉ thị khác đã biết trước vị trí nhiễm sắc thể như: RFLP hay microsattelite.


http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-27-tim_hieu_phuong_phap_pcr.ozu7IyOtZz.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52220/
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Phương pháp PCR
I. Phương pháp PCR
1. Khái niệm
PCR (Polymerase Chain Reaction) (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứng chuỗi Polymerase, hay phản ứng PCR). Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo nhằm tạo ra các đoạn ADN mới.
2. Các thành phần chính của PCR
Các thành phần chính của PCR gồm: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR
Phản ứng được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máy PCR.
2.1. ADN khuôn
ADN khuôn (DNA template) hay còn gọi là ADN mục tiêu được sử dụng làm cái khuôn để các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau đó với sự tham gia của các thành phần cần thiết, phản ứng tổng hợp sẽ diễn ra tạo lên một đoạn ADN mới giống hệt đoạn ADN nằm giữa hai vị trí gắn mồi. Từ chu kỳ thứ hai trở đi, ngoài ADN khuôn ban đầu, những đoạn ADN vừa được tổng hợp cũng được sử dụng làm khuôn cho những chu kỳ tổng hợp tiếp theo.
Lượng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ 20ng đến 100ng. Do lượng ADN cần thiết nhỏ như vậy, nên khi chuẩn bị ADN khuôn phải hết sức chú ý tránh bị lẫn ADN từ các nguồn khác và cần có ADN khuôn với độ nguyên vẹn cao.
2.2. Mồi PCR
Mồi là một đoạn oligonucleotít ngắn, có chiều dài khoảng từ 6 đến 70 nucleotít.
Những mồi ngẫu nhiên (mồi RAPD) có chiều dài khoảng 10 nucleotít và đa số các mồi PCR có chiều dài khoảng 20 dến 30 nucleotít.
- Thiết kế mồi
Khi thiết kế mồi, người ta thường quan tâm sao cho không có sự bổ sung giữa các bazơ trong cùng một mồi và giữa các mồi. Vì phản ứng tổng hợp được bắt đầu từ đuôi 3’ của mồi; do vậy để nâng cao hiệu quả gắn mồi và tính đặc hiệu của phản ứng, người ta thường quan tâm đến việc thiết kế sao cho đuôi 3’ của chúng là các bazơ G hay C để tạo ra sự bắt cặp chắc hơn và đặc hiệu hơn so với cặp A và T.
- Nhiệt độ gắn mồi
Trong PCR phải tìm được nhiệt độ thích hợp nhất cho mồi gắn vào ADN khuôn. Để xác định nhiệt độ gắn mồi tương đối ban đầu, người ta đã dựa trên những công thức toán khác nhau.
*Đối với những mồi có chiều dài ≤ 20 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức sau:
Tm ( oC) = {2 x (A + T) + 4 x (G + C)}
VD: một mồi có trình tự nucleotide như sau: CAG CAA ATA TCT GTC CTT AC, nhiệt độ gắn mồi tương đối sẽ là: Tm = 2 x 12 + 4 x 8 = 56 oC.
*Đối với những mồi có chiều dài từ 20 đến 35 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức:
Tm ( oC) = 22 + 1,46 x {[2 x (C +G) + ( A + T)]}
*Đối với những mồi có chiều dài từ 35 đến 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức:
Tm ( oC) = 81,5 + 16.6 log10C+ + 0,41 (% của G + C) – 600/L.
C+ là nồng độ của cation hoá trị một (Na+), tính theo nồng độ của phân tử; L là chiều dài mồi.
Trong thực tế nhiệt độ gắn mồi có thể dao động từ 30C đến 150C so với nhiệt độ tính toán được từ các công thức. Các công thức nêu trên chỉ để tham khảo; nhiệt độ gắn mồi tối ưu được rút ra qua thí nghiệm cụ thể.
+ Nồng độ mồi
Nồng độ mồi có thể được sử dụng vào khoảng 100 đến 500 nM. Tuy nhiên nồng độ cụ thể phụ thuộc vào từng thí nghiệm và mục đích nghiên cứu. Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽ không đủ cho phản ứng và nồng quá cao có thể dẫn tới sai lệch kết quả.
+ Thời gian gắn mồi
Thời gian gắn mồi vào khuôn thường dao động trong khoảng 30 đến 60 giây. Nếu thời gian gắn mồi lâu sẽ gây ra sai lệch kết quả phản ứng do sự gắn mồi không đặc hiệu, hơn nữa sẽ kéo dài thời gian phản ứng làm suy giảm sự hoạt động của enzym Taq.
2.3. dNTP
dNTP (A, T, G, C là những “viên gạch” để xây dựng lên sợi ADN mới trong phản ứng chuỗi. Nồng độ của dNTP thường sử dụng cho mỗi phản ứng là 200mM. Nếu nồng độ dNTP quá cao nó sẽ liên kết với Mg2+, một ion rất cần cho sự hoạt động của enzym tổng hợp, vì vậy mà sẽ ảnh hửng tới phản ứng tổng hợp. dNTP rất nhậy cảm với sự thay đổi nhiệt độ, cứ sau 35 chu kỳ của PCR thì dNTP hầu như đã bị suy giảm; trong một môi trường axít nó sẽ chuyển hoá nhanh thành dNDP và dNMP. Do vậy mà dNTP là chất không bền, đặc biệt sử dụng cho PCR.
2.4. Enzym tổng hợp ADN.
Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR. Trong điều kiện thích hợp cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nên ADN mới. Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tính của nó; có thể sử dụng từ 1 đến 2 đơn vị enzym sẽ cho hiệu quả tốt nhất với PCR có thể tích 25ml. Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glycerol trong dung dịch phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa các vị trí và tạo ra hình ảnh điện di không rõ nét. Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếu enzym và kết quả nhận được là sản phẩn tổng hợp không đầy đủ.
2.5. Dung dịch đệm PCR
Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl2 và Tris. Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng, thông thường những mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hơn thì hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn và ngựơc lại những đôi mồi cho sản phẩm PCR ngắn hơn sẽ hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối cao hơn. MgCl2 là nhân tố cần thiết để enzym Taq hoạt động, nếu nồng độ MgCl2 thấp, sẽ ức chế sự hoạt động của enzym Taq, tuy nhiên nếu nồng độ quá cao sẽ cho kết quả PCR không đặc hiệu. Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định, sự thay đổi nồng độ của Tris không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phản ứng PCR.
2.6. Thể tích phản ứng:
Thể tích không ảnh hưởng tới kết qủa của phản ứng, nếu chúng ta sử dụng ống PCR nhỏ có thành mỏng và sử dụng loại máy PCR không cần dầu để chống bay hơi dung dịch. Thể tích phản ứng có thể được điều chỉnh từ 5ml đến 100ml, tuy nhiên nếu với cùng lượng ADN khuôn, thể tích PCR nhỏ sẽ cho nồng độ sản phẩm lớn hơn so với thể tích PCR lớn.
2.7. Chu kỳ phản ứng:
Các thí nghiệm cho thấy số chu kỳ cần áp dụng cho một phản ứng từ 25 đến 45 là vừa đủ. Nếu tiếp tục tăng số chu kỳ, thậm trí lên tới 60 chu kỳ thì sản phẩm PCR có tăng lên nhưng không đáng kể.
3. Nguyên lý phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR (xem file powerpoint)
Khi chúng ta chuẩn bị một dung dịch phản ứng gồm các thành phần cơ bản như: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR.v.v. Dung dịch phản ứng trong ông PCR được đặt trong máy PCR và hoạt động theo sơ đồ nguyên lý sau:
ADN khuôn
5’
3’
ADN khuôn biến tính (94oC-95oC)
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Mồi gắn vào ADN khuôn (35oC - 65oC)
Tổng hợp ADN (72oC)
3’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
II. Các kỹ thuật PCR
Một số kỹ thuật đang được ứng dụng phổ biến trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật gồm: (1) Kỹ thuật RT-PCR; (2) Kỹ thuật RAPD; (3) Kỹ thuật AFLP; (4) Kỹ thuật STS; (5) Kỹ thuật CAPS; (6) Kỹ thuật SSR (xem file powerpoint)
1. Kỹ thuật RT-PCR
RT-PCR (reverse transcription PCR) là kỹ thuật dùng để tổng hợp cADN từ mARN. Kỹ thuật này được tiến hành như sau: trước tiên, người ta tách ARN thông tin từ tế bào, sau đó tiến hành phản ứng PCR để phiên mã ngược từ ARN thành cADN, ở giai đoạn này cá...

---