Download miễn phí Đề tài Phân tích acid amin



MỤC LỤC
I. Giới thiệu về acid amin 1
1) Thành phần và cấu tạo 1
2) Màu sắc, mùi vị 1
3) Tính tan 1
4) Tính quang học 1
5) Tính lưỡng tính 3
II. Thu nhận acid amin 3
A. Tinh sạch protein trước khi thu nhận 3
B. Các phương pháp thu nhận protein 6
III. Định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký 7
1) Sắc ký giấy 7
2) Sắc ký lớp mỏng 8
3) Sắc ký khí 8
IV. Một vài phương pháp cụ thể 8
A. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey) 8
B. Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong phân tích sắc ký với dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl 13
V. Tài liệu tham khảo 34
 
 
 
 
 


http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2014-01-01-de_tai_phan_tich_acid_amin.aO2N6Lr66X.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52832/
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

màng PVDF vào đáy của ống thủy phân.
2. Thủy phân như bình thường. Sau khi acid đã được làm khô từ mẫu thủy phân, thêm 10 µg methanol. Chiết 2 lần với 50 µL dung dịch gồm 20% MeOH, 0,1N HCl và chuyển đến ống Eppendorf 0,5mL.
3. Đặt ống Eppendorf vào thùng PICOTAG và làm khô nó.
4. Pha loãng với dung dịch đệm loãng và lọc, dùng một cột vi xoáy. Mẫu đã sẵn sàng để phân tích acid amin.
Thu nhận acid amin bằng thủy phân protein:
Thủy phân bằng acid:
Để thu nhận acid amin, phương pháp thường được dùng nhất là thủy phân bằng dung dịch HCl 6N dư ở nhiệt độ 100-120oC trong 24 giờ. Sản phẩm thu được chủ yếu là các acid amin dưới dạng tự do dưới dạng hydrogenclorate. Một số acid amin như serine và threonine bị phá hủy một phần, tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagines bị phân hủy thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+.
Thủy phân bằng kiềm:
Người ta còn có thể thu nhận acid amin bằng phương pháp thủy phân với dung dịch NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ. Sản phẩm thu được hầu hết là các acid amin nhưng đều bị racemic hóa, các acid amin cysteine, serine, threonine bị phá hủy nhưng tryptophan không bị phá hủy. Vì vậy, phương pháp thủy phân bằng kiềm thường chỉ dùng để xác định tryptophan.
Thủy phân bằng enzyme:
Để thu nhận chế phẩm acid amin, ngày nay việc thủy phân bằng enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau do việc sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm.
Các enzyme thủy phân protein thành các acid amin hay các peptide có phân tử lượng thấp được gọi chung là peptidhydrogenlase. Có nhiều loại peptidhydrogenlase, chúng được phân biệt nhờ tính đặc hiệu khác nhau với liên kết peptid. Một số loại cắt đứt liên kết peptide ở đầu tận cùng của chuỗi polypeptide được gọi là exopeptidase như carboxypeptidase phân giải liên kết peptide đầu C tận cùng, aminopeptidase phân giải liên kết peptide đầu N tận cùng. Một số khác chỉ cắt đứt ở giữa chuỗi polypeptide được gọi là các endopeptidase như pepsin, tripsin…
Định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký:
Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu nguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tích acid amin.
1) Sắc ký giấy
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (trong điều kiện bảo hoà hơi nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung môi di động thường là một dung môi hữu cơ bảo hoà nước di chuyển trên tờ giấy theo mao dẫn kéo theo các chất trong dung dịch. Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định gọi là Rf.
Trong đó: - a là khoảng cách chuyển dịch của chất phân tích
- b là khoảng cách chuyển dịch của dung môi
Có nhiều kiểu sắc ký giấy khác nhau, đó là sắc ký một chiều đi lên, sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký vòng nằm ngang và sắc ký hai chiều. Loại giấy thường dùng là Whatman số 1 và Schleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol:1 Acetic acid: 5 Nước (dùng cho chiều thư nhất); 3 Phenol: 1 Nước (dùng cho chiều thứ hai).
2) Sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên một phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp. Dung môi di chuyển làm dịch chuyển các chất trong mẫu thử. Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, alumin oxyt, sephadex ,v.v...được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính
3) Sắc ký khí
Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các acid amin nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường là N-acetyl-amin). Cho tác dụng acid amin với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với anhydrid acetic. Cột thường dùng là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglycol 1% (carbowax 1564 hay 6000). Chương trình nhiệt giữa 125o C và 155oC, tốc độ chảy 60-240 mL/phút.
Một vài phương pháp cụ thể
Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey)
Giới thiệu
Việc tạo dẫn xuất của acid amin kèm theo việc phân tích sắc ký lỏng cao áp có đảo pha (RP-HPLC) được xem là phương pháp thích hợp nhất để phân tích acid amin. Các bước tạo dẫn xuất không chỉ cần thiết cho sự tương tác với pha không phân cực và ổn định, mà còn cần cho việc đo quang.
Thuốc thử Marfey 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide hay (S)-2-[(5-fluoro-2,4-dinitrophenyl)-amino]propanamide được sử dụng để tách và xác định cấu hình acid amin. Thuốc thử phản ứng hóa học với nhóm amino của đối hình acid amin để tạo ra dẫn xuất ổn định mà có thể tách bằng phương pháp RP-HPLC (hình 1). Dinitronphenyl alanine amid hấp thu mạnh bước sóng 340 nm (ε = 30000 M-1 cm-1), điều này cho phép đầu dò xác định được ở phạm vi subnmol.
Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey cũng được dùng để định lượng 19 L-acid amin thường gặp. Ưu điểm của thuốc thử Marfey là:
Có khả năng tạo sắc phổ trên bất kỳ thiết bị phân tích HPLC nào mà không cần tăng nhiệt độ cột phản ứng.
Những dung môi không tinh khiết khác khó dò được bước sóng 340 nm.
Phát hiện cả sự có mặt của proline khi chạy cột sắc ký đơn.
Tạo dẫn xuất acid amin ổn định.
Kỹ thuật đo đơn giản này đem lại cho những nhà phân tích acid amin một phương pháp hiệu quả và rẻ tiền. Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey còn có những ứng dụng trong các lĩnh vực hóa sinh, trong đó có việc xác định cơ chất và sản phẩm trong những phản ứng enzyme của acid amin.
Hình 3: Thuốc thử Marfey (I) và L,L-dẫn xuất từ L-acid amin và thuốc thử (II)
Nguyên liệu-Thiết bị:
Thủy phân protein
Ống nghiệm bằng thủy tinh chịu nhiệt kích thước 25-50 x 5 mm
Ống nghiệm thủy tinh có nắp khoen siết chặt
Dung dịch HCl 6N
Phản ứng thu nhận dẫn xuất
dd acid amin chuẩn
Bộ kit thử L-acid amin chuẩn LAA21
Thuốc thử Marfey. Lưu ý: thuốc thử Marfey là dẫn xuất của 1-fluoro-2,4-trinitrobenzene, chất nghi ngờ là có khả năng gây ung thư nên cần thận trọng khi sử dụng.
HPLC grade triethylamine, methanol, acetone và dimethyl sulfoxide (DMSO)
Phân tích sắc ký:
Hệ thống vận chuyển dung môi: bất kỳ thiết bị phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp nào cũng có thể sử dụng để thu nhận dẫn xuất của acid amin.
Cột sắc ký: cột silicat C8 chuyển đổi pha, ví dụ như: LiChrospher 100 RP 8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel), Aquapore RP 300 (220 x 4.6 mm; 7 μm from Perkin-Elmer), Nucleosil 100-C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel), or Vydac C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from The Separations group).
Đầu dò UV/vis kèm theo ô chứa chất lỏng dài 0.5-1 cm, thể tích 3-5 µL. Dẫn xuất của acid amin được phát hiện ở 340 nm.
Tổng hợp peak: các phần mềm máy tính được dùng để tổng hợp và định lượng peak của acid amin
Dung môi: phải được chuẩn bị với HPLC grade và phải được loại khí
Dung môi A: 13 mM trifluoroacetic acid (TFA) cùng với 4% (v/v) tetrahydrofuran trong nư

---