Download miễn phí Luận văn Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn dna vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α
MỤC LỤC
Trang
Lời Thank . i
Tóm tắt . ii
Mục lục .iii
Danh sách các chữ viết tắt . vii
Danh sách các hình . vii
Danh sách các bảng . ix
PHẦN 1. MỞ ĐẦU . 1
1.1 Đặt vấn đề . 1
1.2 Mục tiêu của đề tài. 2
1.3 Nội dung thực hiện . 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
2.1 Hiện tương biến nạp ở vi khuẩn . 3
2.1.1 Giới thiệu về hiện tượng biến nạp . 3
2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tượng biến nạp . 3
2.1.3 Cơ chế của hiện tượng biến nạp . 5
2.1.4 Vai trò của hiện tượng biến nạp . 5
2.1.5 Ứng dụng của hiện tượng biến nạp . 5
2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp . 6
2.2.1 Khái niệm chung các vector . 6
2.2.2 Plasmid . 7
2.2.2.1 Cấu trúc . 7
2.2.2.2 Tính chất của plasmid . 8
2.2.2.3 Phân loại plasmid . 8
2.2.3 Phage . 9
2.2.4 Chủng chủ E.coli . 9
2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp . 10
2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) . 11
2.3.1.1 Hiện tượng giới hạn . 11
2.3.1.2 Tên gọi các RE . 11
2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn . 12
2.3.1.4 Các RE loại II . 12
2.3.2 Các enzym thông dụng khác . 15
2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) . 15
2.3.2.2 Taq polymerase . 15
2.3.2.3 Terminal transferase . 15
2.3.2.4 Các DNase . 15
2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa . 16
2.3.3 Các enzym nối DNA . 16
2.3.3.1 E.coli DNA ligase . 16
2.3.3.2 T4 DNA ligase . 16
2.4 Các phương pháp sử dụng trong biến nạp . 17
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 17
2.4.1.1 Phương pháp hóa biến nạp . 17
2.4.1.2 Phương pháp điện biến nạp . 18
2.4.2 Phương pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp . 18
2.4.3 Chiết tách DNA plasmid . 19
2. 5 Điện di (Electrophoresis) . 19
2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nước và ngoài nước . 20
2.6.1 Ngoài nước . 20
2.6.2 Trong nước . 21
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp . 22
3.2 Vật liệu nghiên cứu . 22
3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α. 22
3.2.2 pBluescript II SK(+/-) . 22
3.2.3 Đoạn DNA . 23
3.3 công cụ và hóa chất . 23
3.3.1 công cụ thí nghiệm . 23
3.3.2 Các thiết bị máy móc . 23
3.3.3 Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn . 23
3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm . 24
3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm . 24
3.4 Phương pháp nghiên cứu . 25
3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn . 25
3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn
E.coli DH5α và kiểm tra . 26
3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trường LB . 27
3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 27
3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt
(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) . 27
3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra . 29
3.4.6.1 Chiết tách plasmid . 29
3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid
(quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) . . 32
3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose . 32
3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR . 33
3.4.7.1 Phương pháp tinh sạch DNA . 33
3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel . 33
3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX . 34
3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR . 35
3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn
DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) . 36
3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) . 37
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 38
4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn . 38
4.2 Tách chiết DNA plasmid . 40
4.2.1 Tách chiết DNA plasmid . 40
4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTMPlasmid Mini Kit . 42
4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV . 42
4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII . 44
4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA. 44
4.4.2 Tinh sạch plasmid . 45
4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp . 46
4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp . 46
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 48
5.1 Kết luận . 48
5.2 Kiến nghị . 49
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2014-01-01-luan_van_hoan_thien_quy_trinh_bien_nap_doan_dna_va.dYYqKYlo44.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52763/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
................................................................................... 7
2.2.2.2 Tính chất của plasmid .......................................................................... 8
2.2.2.3 Phân loại plasmid ................................................................................ 8
2.2.3 Phage ............................................................................................................ 9
2.2.4 Chủng chủ E.coli .......................................................................................... 9
2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp ......................................................................... 10
2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) ..................................................................... 11
iv
2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn ........................................................................... 11
2.3.1.2 Tên gọi các RE .................................................................................. 11
2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn .................................................................... 12
2.3.1.4 Các RE loại II .................................................................................... 12
2.3.2 Các enzym thông dụng khác ...................................................................... 15
2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) ........................................................ 15
2.3.2.2 Taq polymerase ................................................................................. 15
2.3.2.3 Terminal transferase .......................................................................... 15
2.3.2.4 Các DNase ......................................................................................... 15
2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa ......................................................... 16
2.3.3 Các enzym nối DNA .................................................................................. 16
2.3.3.1 E.coli DNA ligase .............................................................................. 16
2.3.3.2 T4 DNA ligase ................................................................................... 16
2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp .......................................................... 17
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 17
2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp ................................................................ 17
2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp ............................................................... 18
2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp ................... 18
2.4.3 Chiết tách DNA plasmid ............................................................................ 19
2. 5 Điện di (Electrophoresis) ................................................................................... 19
2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc .................................. 20
2.6.1 Ngoài nƣớc ................................................................................................. 20
2.6.2 Trong nƣớc ................................................................................................. 21
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 22
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp ....................................... 22
3.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 22
3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α............................................................................... 22
3.2.2 pBluescript II SK(+/-) ................................................................................ 22
3.2.3 Đoạn DNA ................................................................................................. 23
3.3 công cụ và hóa chất ........................................................................................... 23
3.3.1 công cụ thí nghiệm .................................................................................... 23
v
3.3.2 Các thiết bị máy móc ................................................................................. 23
3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ...................................................... 23
3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ................................................... 24
3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm ...................................................... 24
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 25
3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ....................................... 25
3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn
E.coli DH5α và kiểm tra .......................................................................... 26
3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trƣờng LB ............................... 27
3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 27
3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) ................................. 27
3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra ............................... 29
3.4.6.1 Chiết tách plasmid ............................................................................. 29
3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid
(quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) ...................................... 32
3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose ..................................................... 32
3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR .................................. 33
3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA ............................................................. 33
3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel ........................................................ 33
3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX ................... 34
3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ............................... 35
3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn
DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ................................................ 36
3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) ............ 37
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 38
4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .......................................... 38
4.2 Tách chiết DNA plasmid .................................................................................... 40
4.2.1 Tách chiết DNA plasmid ........................................................................... 40
vi
4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit ..................... 42
4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV ................................... 42
4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII ................................ 44
4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA.................................................................................. 44
4.4.2 Tinh sạch plasmid ...................................................................................... 45
4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp ................................................................................ 46
4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp ............................................................................. 46
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 48
5.1 Kết luận ............................................................................................................... 48
5.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 49
vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp base pair
CFU Colony Form Unit
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate
ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid
IPTG Isopropyl-β-D-...
