Download miễn phí Urease và protease trong thể tiết của helicobacter pylori, chủng VNH -85
Hoạt tính protease của các dịch thể được phát hiện khi gel
được tẩy bằng dung dịch 40% ethanol và 10% acid acetic
(hình 3). Trên ảnh chụp, ít nhất một băng protein có phân
tử lượng khoảng 50 kDa đã xuất hiện trên zymoram đồ.
Như vậy, các protein urease và protease, ngoài cagA,
HP1125 và vacA đã được phát hiện trong thể tiết của chủng
vi khuẩn Helicobacter pyloriVNH-85 (Việt Nam). Các
dịch thể, do vậy chứa nhiều các protein bệnh lý quan trọng
của vi khuẩn. Do các dịch thể có thể xâm nhập vào bên
trong tế bào ung thư AGS gây nên các thay đổi nhất định
bên trong tế bào trong điều kiện invitro, nên chúng có thể là
một trong các phương tiện tương tác của vi khuẩn HP và
vật chủ. ý nghĩa của từng loại protein có trong dịch thể và
ảnh hưởng của nó đối với con người trong điều kiện invivo
chưa được biết rõ.
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-27-urease_va_protease_trong_the_tiet_cua_helicobacter.wIzjnLLPMb.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52424/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
UREASE VÀ PROTEASE TRONG THỂ TIẾT CỦA
Helicobacter pylori, CHỦNG VNH - 85
Nguyễn Hoàng Uyên & Nguyễn Thị Hồng Hạnh
Viện Công Nghệ Sinh học
I. MỞ ĐẦU
Các dịch thể có nguồn gốc từ màng ngoài của Helicobacter
pylori mang một số protein là yếu tố bệnh lý như VacA [1],
CagA và HP1125 [2, 3]. Các protein đã được xác định là
những độc tính gây bệnh của vi khuẩn. Các nghiên cứu ở
điều kiện invitro cho thấy, các dịch thể có thể xâm nhập
vào bên trong tế bào ung thư dạ dày AGS, gây nên sự
cường tiết của interleukin IL-8 [4]. Có đến 80% số tế bào
AGS bị chết dưới ảnh hưởng của các độc chất chứa trong
dịch thể. Những tế bào sống sót đã tăng sinh gấp hai lần
[5].
Urease là một trong những yếu tố giúp cho vi khuẩn
Helicobacter pylori sống trong dạ dày của ngưòi, do phân
huỷ urea và nâng cao độ pH của dịch dạ dày [6,7]. Urease
tổng hợp trong tế bào vi khuẩn và có thể được đưa ra bên
ngòai theo cơ chế tự autolysis [6, 7].
Trong bài báo này, chúng tui thông báo phát hiện urease và
protease trong các dịch thể của vi khuẩn Helicobacter
pylori, chủng VNH-85 phân lập từ một bệnh nhân Việt
Nam bị loét dạ dày. Đây là 2 protein, sau cagA, VacA và
HP1125 được tìm thấy trong các thể dịch của vi khuẩn.
Như vậy, sự có mặt của nhiều protein trong dịch thể của vi
khuẩn Helicobacter pylori mang các hoạt tính sinh học
khác nhau nhấn mạnh các vai trò chưa biết của chúng trong
quá trình phát triển bệnh ở người.
II. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
1. Nguyên liệu
- Phân lập chủng vi khuẩn
Vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VHN - 85 được phân
lập và nuôi cấy như đã miêu tả [8]. Sau khi nuôi ở điều kiện
chuẩn trong ba ngày, vi khuẩn được thu thập cho các
nghiên cứu tiếp.
2. Phương pháp
- Tách chiết các dịch thể
Các dịch thể được thu nhận như đã miêu tả [9]. Chế phẩm
được bảo quản ở –200C trong vòng một năm.
- Xác định hoạt tính urease
a) Các dịch thể được ủ trong 0,.2 ml dung dịch đệm
phosphate pH = 6 (Urea 2%; NaH2PO4 0.428% và
Na2HPO4 1% ) trong 30 phút ở 370 C. 10 l của phản ứng
được lấy ra ở các thời điểm khác nhau để xác định hàm
lượngNH3
b) bằng phương pháp Berthellot.
NH3 được xác định theo phương pháp của Berthellot như
sau:
Chuẩn bị ba dung dịch có thành phần:
1) 2% Na - phenolate
2)50 gram Na Nitroprusside trong 1 lit nước cất
3)15% NaOCl
Các dung dịch được chuẩn bị và bảo quản lạnh.
Phản ứng định lượng màu được tiến hành như sau: Cho 0.1
- 1 l mẫu vào ống nghiêm sạch và 2 ml nước cất. Cho
thêm vào ống nghiệm 3 dung dịch đã chuẩn bị như trên
theo thứ tự 1ml dung dịch 1; 0. 5 ml dung dịch hai và ba.
Lắc ống nghiệm sau mỗi lần cho chất vào. Các ống nghiệm
được ủ ở nhiệt độ phòng khỏang 30 phút, sau đó tiến hành
đo OD ở bước sóng 630nm. Đường chuẩn được xây dưng
cho các hàm lượng NH3 là 0-5 g. Phương pháp cho phép
xác định lượng NH3 nhỏ nhất là 0.5 g.
- Xác định hoạt tính protease của các dịch thể
Sự có mặt của các protease trong dịch thể được xác định
bằng phương pháp SDS-PAGE zymogram protease. Tủa
dịch thể trong cồn tuyệt đối (1:1) ở –200C. Ly tâm tủa ở
4oC trong 15 phút, sau đó hoà tủa trong nước cất để chạy
điện di SDS-PAGE 70V trong 2 giờ. Sau SDS-PAGE, ủ gel
trong dung dịch 3% casein đệm Tris-HCl 50 mM, pH 8 ở
400C trong vòng 30 phút, sau đó rửa sạch gel trong nước
cất và nhuộm bằng dung dịch 40% ethanol, 10% acid
acetic, 0.1 % Coomasie Blue trong 4 giờ. Sau khi tẩy trong
dung dịch 40% ethanol., 10% acid acetic, băng protein có
hoạt tính protease hiện lên màu trắng. Protein albumin
chuẩn được sử dụng làm đối chứng.
III - KẾT QUẢ
1. Phát hiện sự thay đổi pH của dịch đệm
Các dịch thể sau khi được tách chiết từ dịch nổi nuôi cấy
của vi khuẩn Helicobacter pylori bằng phương pháp siêu ly
tâm được ủ trong dung dịch đệm có pH = 6,9. Sau một vài
phút, màu của dung dịch đã đổi từ vàng sang đỏ, chứng tỏ
có sự thay đổi pH từ vùng acid sang vùng kiềm ( hình 1).
Tính chất nói trên được bảo toàn khi tiến hành thí nghiệm
với các chế phẩm được bảo quản ở - 20oC trong nhiều năm.
2. Xác định NH3 giải phóng ra trong phản ứng sinh hoá
Sự dịch chuyển pH của dung dịch đệm có thể do một chất
nào đó có bản chất kiềm đã xuất hiện trong quá trình ủ dịch
thể với urea. Trong trường hợp, dung dịch đệm không chứa
urea, hiện tượng chuyển dịch pH đã không xẩy ra. Như thế,
các kết quả cho phép kết luận urea chính là cơ chất của
phản ứng sinh hoá mà chúng tui vừa trình bầy.
Các phân tích sử dụng phương pháp của Berthellot để xác
định NH3 cho thấy NH3 đã được giải phóng trong quá trình
men học nói trên (hình 2a và 2b). Trên biểu đồ, thời gian
cần thiết (lag time) để bắt đầu phản ứng hoá học là 15 phút.
Tốc độ giải phóng NH3 tỷ lệ thuận với thời gian của phản
ứng.
3. Xác định hoạt tính protease của các dịch thể.
Hoạt tính protease của các dịch thể được phát hiện khi gel
được tẩy bằng dung dịch 40% ethanol và 10% acid acetic
(hình 3). Trên ảnh chụp, ít nhất một băng protein có phân
tử lượng khoảng 50 kDa đã xuất hiện trên zymoram đồ.
Như vậy, các protein urease và protease, ngoài cagA,
HP1125 và vacA đã được phát hiện trong thể tiết của chủng
vi khuẩn Helicobacter pylori VNH-85 (Việt Nam). Các
dịch thể, do vậy chứa nhiều các protein bệnh lý quan trọng
của vi khuẩn. Do các dịch thể có thể xâm nhập vào bên
trong tế bào ung thư AGS gây nên các thay đổi nhất định
bên trong tế bào trong điều kiện invitro, nên chúng có thể là
một trong các phương tiện tương tác của vi khuẩn HP và
vật chủ. ý nghĩa của từng loại protein có trong dịch thể và
ảnh hưởng của nó đối với con người trong điều kiện invivo
chưa được biết rõ.
Hình 1- Sự thay đổi pH của dung dịch đệm khi ủ với các
dịch thể.
5 g dịch thể được ử trong 200 l dung dịch đệm
phosphate pH 6,9.
a) mẫu thí nghiệm
b) mẫu đối chứng không có dịch thể.
Hình 2- Xác định NH3 được giải phóng trong phản ứng
sinh hoá.
A - Đường chuẩn đo hàm lượng NH3 Trục tung chỉ OD,
còn trục hoành biểu diễn hàm lượng NH3 trong mẫu. 1:
0.5.; 2: 1; 3: 1,5... g NH3 )
Hình 3. Một protease có phân tử lượng khoảng 50 kDa
(được chỉ bằng mũi tên) được tìm thấy trong thể dịch của
Helicobacter pylori.
1. Mẫu dịch thể
2. Protein chuẩn có phân tử lượng 97, 66, 45,30, 20 và
16 kDa theo thứ tự từ trên xuống dưới,
IV- KẾT LUẬN
1. Bằng các phương pháp sinh hoá, chúng tui đã phát hiện
sự có mặt của men urease trong các dịch thể tiết của vi
khuẩn Helicobacter pylori, chủng VNH-85 phân lập từ một
bệnh nhân Việt Nam bị loét dạ dày.
2. Bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và sử dụng
casein làm cơ chất, chúng tui đã phát hiện một protease có
phân tử lượng khoảng 50 kDa trong dịch thể của vi khuẩn
Helicobacter pylori, chủng VNH-85.
3. Các dịch thể, do mang nhiều protein bệnh lý là có thể là
phương tiện tương tác của vi khuẩn với người bệnh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 - Fiocca, R; Necchi, V; Sommi, P., Ricci, V; Telford, J;
Cover, T.L; Solicia, E (1999). Release of Helicobacter
pylori vacuolating cytotoxin by both a specific secrection
pathway and budding of outer membrane vesicles. Uptake
of releas...
