Download miễn phí Đề tài Sử dụng bức xạ gamma và chỉ thị phân tử liên kết với tính chịu hạn để tạo giống lúa chịu hạn
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đại cương về cây lúa 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại lúa trồng 3
1.1.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam và trên thế giới 4
1.2. Đại cương về tính chịu hạn ở cây trồng 5
1.2.1. Hạn và tác hại của hạn lên thực vật 5
1.2.1.1. Khái niệm và phân loại hạn 5
1.2.1.2. Tác hại của hạn lên thực vật 6
1.2.2. Cơ chế chống chịu hạn 7
1.2.2.1. Cơ chế lẩn tránh hạn 7
1.2.2.2. Cơ chế chịu hạn ở thế nước trong mô cao 8
1.2.2.3. Cơ chế chịu hạn ở thế nước trong mô thấp 9
1.2.2.4. Cơ chế phục hồi sau hạn 11
1.2.3. Các biện pháp khắc phục nâng cao nâng cao tính chịu hạn 11
1.3. Một số phương pháp tạo dòng chịu hạn 13
1.3.1. Chọn giống chịu hạn thông qua kỹ thuật chọn dòng tế bào 13
1.3.2. Chọn giống chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen 13
1.3.3. Chọn lọc tính chịu hạn nhờ chỉ thị phân tử MAS 14
1.4. Đột biến phóng xạ trong tạo giống 14
1.4.1. Các thành tựu về chọn tạo giống đột biến 14
1.4.2. Đột biến và các nhân tố gây đột biến 16
1.4.3. Bức xạ ion hóa và cơ chế gây đột biến 17
1.4.3.1. Bức xạ ion hoá 17
1.4.3.2. Cơ chế tác động 18
1.4.4. Phương pháp đột biến nhân tạo ở cây trồng 19
1.5. Một số chỉ thị phân tử sử dụng trong chọn dòng chịu hạn ở lúa 20
1.5.1. Phản ứng PCR 20
1.5.2. Kỹ thuật RAPD và ứng dụng 22
1.5.3. Kỹ thuật SSR và ứng dụng 23
1.5.4. Kỹ thuật STS và ứng dụng 24
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26
2.1. Vật liệu 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu 26
2.2.1. Phương pháp xử lý phóng xạ 26
2.2.2. Phương pháp xử lý hạn PEG với các cây M0 26
2.2.3. Phương pháp tách chiết ADN hệ gen 27
2.2.4. Phương pháp phân tích RAPD 29
2.2.4.1. Phản ứng PCR với các mồi RAPD 29
2.2.4.2. Phương pháp phân tích số liệu RAPD 31
2.2.5. Phương pháp phân tích SSR 32
2.2.5.1. Phản ứng PCR với các mồi SSR 32
2.2.5.2. Phương pháp phân tích số liệu SSR 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
3.1. Ảnh hưởng của phóng xạ lên khả năng nảy mầm của hạt 35
3.2. Ảnh hưởng của phóng xạ lên sinh trưởng và phát triển của cây mạ 36
3.3. Kết quả xử lý PEG 37
3.4. Kết quả phân tích RAPD 41
3.4.1. Kết quả tách chiết AND hệ gen 41
3.4.2. Phân tích đa dạng di truyền các dòng lúa 42
3.4.3. So sánh sự khác nhau của các dòng lúa ở mức độ phân tử 45
3.5. Kết quả phân tích SSR 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2014-03-23-de_tai_su_dung_buc_xa_gamma_va_chi_thi_phan_tu_lie.jHtYn7nDO6.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-64361/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
ếu xạ là hạt khô).
Bảng 2. Liều tới hạn và liều chiếu xạ ở một số cây trồng chính
Cây trồng
Liều tới hạn (krad)
Liều chiếu xạ (krad)
Lúa mỳ
10-15
5-10
Lúa nước
30-35
15-20
Ngô
10-15
10-15
Đậu tương
12-15
5-8
1.5. Một số chỉ thị phân tử sử dụng Trong chọn dòng chịu hạn ở lúa
1.5.1. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase), được Kary Mullis & Cs phát minh vào năm 1985. Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo ADN với sự tham gia của các thành phần chính bao gồm: ADN khuôn, dNTP, mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR. Phản ứng được thực hiện trong máy chu trình nhiệt hay còn gọi là máy PCR.
Đoạn khuôn có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật nhân gen qua PCR. Đoạn khuôn có thể là ADN mạch kép, mạch đơn hay ARN được tách chiết từ đối tượng cần nghiên cứu. PCR chỉ cần một lượng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ 20-100 ng, phản ứng lại rất nhạy nên đòi hỏi ADN khuôn có độ nguyên vẹn cao và không bị lẫn tạp.
Mồi PCR là những đoạn oligonucleotid mạch đơn kích thước từ 6-70 bazơ, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự ở hai đầu mạch khuôn. Để đảm bảo hiệu quả PCR, cần thiết kế các mồi xuôi và ngược có trình tự không bổ sung cho nhau, với hàm lượng G, C từ 40-75%, và phải đảm bảo Tm (nhiệt độ nóng chảy) không chênh lệch nhau quá lớn. Hơn nữa khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược không nên quá 1kb.
Enzym DNA polymerase thường sử dụng là Taq polymerase, một loại enzym chịu nhiệt được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao (70-750C). Taq polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra chính xác và đặc hiệu. Nồng độ Taq tối ưu cho phản ứng khoảng 0,5 UI/25μl.
Nồng độ các loại nucleotid khoảng 20-200 μM mỗi loại. Sự mất cân bằng trong hỗn hợp dNTPs sẽ làm giảm độ chính xác của Taq polymerase. Nồng độ các ion trong dung dich đệm, đặc biệt là ion Mg++, có vai trò rất quan trọng trong phản ứng PCR, vì nó ảnh hưởng đến hoạt độ của Taq polymerase, nồng độ thích hợp là khoảng 0,5-5 mM.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn chính: Giai đoạn biến tính, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của ADN khuôn một ít, thường là 94-950C trong 30 giây đến 1 phút, nếu ADN khuôn có tỉ lệ G C cao, chuỗi GC liền nhau dài cần tính toán để có nhiệt độ phù hợp. Giai đoạn gắn mồi, mồi bắt cặp với ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung, nhiệt độ gắn mồi khoảng 300C đến 650C tuỳ từng trường hợp vào độ dài của mồi, thời gian từ 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn tổng hợp, được tiến hành ở 720C là nhiệt độ tối ưu cho Taq polymerase hoạt động, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 5 phút.
Kết thúc mỗi chu kỳ lượng ADN tăng lên gấp đôi và ADN được nhân lên sẽ trở thành ADN khuôn cho những chu kỳ sau. Thông thường đặt khoảng 30-60 chu kỳ. Tuy nhiên số chu kỳ quá lớn sẽ làm tăng sự sai lệch trong quá trình tổng hợp. Vì theo lý thuyết enzym Taq có thể tổng hợp nhầm nucleotid với tỷ lệ 1/106 và tỷ lệ này sẽ tăng dần theo số chu kỳ. Đồng thời số chu kỳ tăng nhưng sản phẩm lại không tăng, do sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng, xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, số các bản sao tạo ra quá nhiều nên các bản sao không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998).
Nhờ tính đặc hiệu và nhanh chóng mà kỹ thuật PCR từ khi ra đời đã có những ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong sinh học phân tử và công nghệ gen. Nó đánh dấu sự ra đời của hàng loạt các chỉ thị phân tử khác dựa trên phản ứng PCR như: RAPD, AFLP, SSR, STS…
1.5.2. Kỹ thuật RAPD và ứng dụng
Phương pháp RAPD (RADNom Amplified Polymorphic DNAs) được William & Cs đề xuất năm 1990, thực chất là quá trình nhân bản các đoạn ADN bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi này sẽ bắt cặp với ADN khuôn ở vị trí bất kỳ nào có trình tự bổ sung với nó. Mồi ngẫu nhiên là các đoạn nucleotid từ 9-12 bases. Phương pháp này tạo ra từ 1-10 đoạn từ một mồi đơn qua phản ứng PCR (Reiter et al, 1992) [38]. Cho sự đa hình cao và có thể được xác định dễ dàng bằng nhuộm EtBr các băng trên gel agarose.
Các đoạn nhân lên bởi RAPD có kích thước từ nhỏ hơn 100 bp đến lớn hơn 2 kb. Và chỉ thị RAPD được xem như là yếu tố trội trong di truyền Mendel ở một cơ thể lưỡng bội vì nó không phân biệt được cây dị hợp tử với cây đồng hợp tử trội.
ưu điểm của RAPD là chỉ cần một lượng ADN nhỏ từ 25-100 ng cho một phản ứng. Các mồi ngẫu nhiên không đòi hỏi trình tự ADN trong cơ thể nghiên cứu và bộ mồi có thể được sử dụng cho nhiều loài khác nhau. Mỗi mẫu cung cấp số liệu của nhiều locus trong hệ gen. Vì vậy những đa hình hiếm trong các cá thể có quan hệ gần gũi có thể được phát hiện nhanh chóng.
RAPD thích hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) và phân tích dòng gần đồng gen (near isogenic line) là các dòng chỉ khác nhau ở một tính trạng.
Trong phản ứng RAPD đoạn mồi gắn với ADN khuôn ở nhiệt độ không cao (30-400C) và các mồi ngẫu nhiên, ngắn nên khả năng tìm điểm gắn trên phân tử ADN là tương đối dễ dàng. Nhưng do mồi ngắn nên dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện gắn mồi, vì thế kết quả nhiều khi không đồng nhất. Và đôi khi hai đoạn ADN có kích thước như nhau từ hai cá thể cùng loài có thể không được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen (Brown, 1996) [23].
1.5.3. Kỹ thuật SSR và ứng dụng
SSR (Simple Sequence Repeats) là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản, còn gọi là phương pháp vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh (Microsetllite). Bộ gen của Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài từng giống. Ví dụ ở lúa có khoảng gần 1000 lần lặp lại trình tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trình tự GATA/CTAT. Nhiều loài cây một lá mầm như ngô, lúa lặp lại đoạn CGG/GGC. Các đoạn ADN thường nằm gần tâm động hay đầu mút của nhiễm sắc thể, có vai trò giữ tính ổn định của bộ nhiễm sắc thể qua quá trình phân bào [16].
Do sự sai khác về kích thước các đoạn lặp lại, nên kỹ thuật SSR rất thích hợp cho nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen. SSR là chỉ thị đồng trội nên đuợc sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử trong quần thể F2. Mồi SSR thường dài khoảng 18-20 bases. Mỗi mồi có từ 1-12 locus được tổ hợp trong một phản ứng PCR cho phép đồng thời ghi nhận các kiểu gen nhiều locus nên tiết kiệm được đáng kể thời gian và hoá chất.
Hạn chế của SSR là đòi hỏi công sức và giá thành cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Bao gồm việc tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa SSR. Tuy nhiên nhiều thành công đạt được đã khiến giá thành của nó giảm đi (Brown, 1996). Sản phẩm PCR sau đó được xác định chính xác bằng điện di trên gel acrylamide và nhuộm bạc.
ở lúa các chỉ thị SSR được xác định là liên kết chặ...
