Tải miễn phí luận văn thạc sỹ sinh học
MỞ ĐẦU
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật, có mặt trong
nguyên liệu, phụ phẩm và chất thải của sản xuất nông, lâm, công nghiệp.
Lignocellulose chứa lignin, hemicellulose và cellulose; trong đó lignin (chiếm
khoảng 20÷30% sinh khối khô) là hợp chất khó bị phân giải nhất. Thành phần
hóa học chính của lignin là polymer của các phenylpropanoid phức tạp được
cấu trúc từ ba loại rượu thơm coniferyl, sinapsyl và p-coumaryl (Elis, 2002).
Trong quy trình sản xuất bột giấy, cần loại bỏ lignin khỏi sinh khối
gỗ và giữ lại bột giấy (cellulose và một phần hemicellulose) sao cho độ dài,
độ bền của xơ sợi chứa cellulose được bảo tồn cao nhất. Một trong các hướng
có triển vọng được quan tâm nhiều là sử dụng các enzyme phân hủy lignin
trong sản xuất bột giấy và giấy (xử lý dăm mảnh nguyên liệu, tẩy trắng bột
giấy, khử màu nước thải) nhằm giảm sử dụng hóa chất và giảm thải các chất
độc hại ra môi trường (Elis, 2002). Các enzyme phân hủy lignin quan trọng
nhất là lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) và laccase (Kirk
et al., 1996; Gettemy et al., 1998; Wang et al., 2004; Hong et al., 2006).
Lignin peroxidase là enzyme phân hủy lignin mạnh nhất, oxy hóa các tiểu
phần lignin không chứa hợp chất phenol (chiếm 90% polymer của các
phenylpropanoide) (Gold et al., 2000; Martinez, 2002). Các nghiên cứu trước
đây cho thấy khi sử dụng enzyme phân hủy lignin từ Phanerochaete
chrysosporium để tẩy trắng bột giấy cho phép giảm 2/3 hàm lượng lignin, độ
trắng của bột tăng 54,6% (Elis, 2002). Ngoài ra, các enzyme phân hủy lignin
được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp khác như xử lý nguyên liệu
phế phụ phẩm nông nghiệp trong sản xuất cồn nhiên liệu, xử lý các nguồn ô
nhiễm lignin hay các hợp chất hydrocarbon đa vòng thơm (Polycyclic
Aromatic Hydrocarbon, PAH)...
Lignin peroxidase được sinh tổng hợp bởi nhiều loại vi khuẩn (thuộc
các chi Pesudomonas, Bacillus, Serritia...), xạ khuẩn (thuộc các chi
Streptomyces, Thermomonospora...), nấm mốc (Aspergillus) hay nấm đảm
(Phanerochaete, Trametes...) sống ký sinh trên thân thực vật bị mục hay
trong các nguồn cơ chất có chứa lignin. Có 6 loại isozyme LiP bao gồm H1,
H2, H6, H7, H8 và H10 đã được tách từ dịch nuôi cấy của P. Chrysosporium
(Leisola et al., 1987; Ollikka et al., 1993). Các isozyme này được cho rằng có
thể tạo ra từ quá trình sửa đổi các protein sau quá trình dịch mã (post-
translational modification). Các gen mã hóa enzyme H2, H6, H8 và H10 đã
được xác định và giải trình tự trong khi một số gen mã hóa các isozyme LiP
khác chưa được xác định. Trong các isozyme trên thì LiP H2 và LiP H8 có
hoạt tính phân hủy lignin cao hơn cả. Khi biểu hiện enzyme LiP H8 tái tổ hợp
trong Escherichia coli, enzyme chỉ có hoạt tính khi được tái cấu trúc từ dạng
thể vùi LiP đã biến tính (denatured inclusion bodies) (Doyle, Smith, 1996).
Biểu hiện LiP H8 trong các vật chủ khác như A. niger (Aifa et al., 1999); P.
chrysosporium (Gelpke et al., 1999) và P. methanolica (Wang et al., 2004),
đã được thực hiện thành công trên thế giới. Hoạt tính rLiP H8 từ A. niger tái
tổ hợp sử dụng vector pGV1503, hoạt tính enzyme đạt 1,125 nkat/mg. Trong
khi đó, Wang và cộng sự biểu hiện rLiP H8 trong P. methanolica có hoạt tính
lần lượt là 932 U/L khi sử dụng vector pMETA và 1933 U/L đối với
pMETαA (Wang et al., 2004). Vì vậy, biểu hiện LiP H8 trong các vi sinh vật
khác nhau nhằm thu LiP hoạt tính cao đang được nhiều nhóm nghiên cứu trên
thế giới quan tâm (Doyle, Smith, 1996; Martinez, 2002; Wang et al., 2004).
Ở Việt Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào biểu hiện các
isozyme LiP từ P. chrysosporium và ứng dụng trong công nghệ sản xuất bột
giấy (Nguyễn Thị Thanh Kiều, Phạm Thành Hổ, 2002). Do vậy, mục tiêu của
của luận văn này là:”Tách dòng và biểu hiện lignin peroxidase isozyme H8
của Phanerochaete chrysosporium trong nấm men Pichia pastoris“ nhằm
thu enzyme tái tổ hợp có hoạt tính cao.
Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lignin-cấu trúc và chức năng
Lignin là một polymer không tham gia vào quá trình trao đổi chất trong
thực vật. Nó thường tập trung ở các mô hoá gỗ, đóng vai trò như chất liên kết
các tế bào, làm tăng sức bền cơ học, khả năng chống thấm, ngăn chặn sự xâm
nhập của các chất độc, các enzyme vi sinh vật và các tác động khác từ bên
ngoài. Lignin có cấu trúc 3 chiều không đồng nhất và là đại phân tử với khối
lượng 600÷1000 kDa. Tuy phức tạp, nhưng về cơ bản, lignin được hình thành
từ 3 loại monomer: p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol
(Hình 1.1). Các monomer này được tích hợp vào lignin dưới dạng các
phenylpropanoid tương ứng là: p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và syringal
(S).
download
