Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nuôi tôm ở Việt Nam đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở
thành một ngành kinh tế quan trọng. Diện tích nuôi tôm cả nƣớc tăng từ 324,1 hecta
năm 2000 lên đến 652.612 hecta vào cuối năm 2013. Chỉ tính 6 tháng đầu năm 2014
cả nƣớc đã thả nuôi 638.422,7 hecta với sản lƣợng thu hoạch đạt 258.730 tấn trong
đó tôm sú là 113.309 tấn và tôm thẻ chân trắng là 149.507 tấn, đạt giá trị xuất khẩu
đạt 1,7 tỷ USD, tăng 54,7% so với cùng kỳ năm 2013.
Tuy nhiên, ngành nuôi trồng tôm thƣờng xuyên gặp khó khăn về việc kiểm
soát các dịch bệnh, trong đó virus gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus -
WSSV) là một trong những tác nhân gây bệnh chính ở tôm. Tôm mỗi khi bị nhiễm
WSSV thì gần nhƣ 100% bị chết sau đó một đến vài tuần. Bệnh đốm trắng có tỷ lệ
lây lan nhanh, cho nên khó có thể lƣờng hết các thiệt hại mỗi khi có dịch. Năm
2013, dịch bệnh đốm trắng trên tôm đã xuất hiện tại 280 xã của 94 huyện thuộc 28
tỉnh, thành phố trong phạm vi cả nƣớc. Tổng diện tích nuôi bị bệnh là 12.259 ha.
Theo báo cáo của Cục Thú y, từ đầu năm 2014 đến 20/7/2014, thiệt hại về nuôi
trồng thủy sản là rất lớn, khoảng 25.000 ha diện tích nuôi tôm bị thiệt hại tại 232 xã,
của 60 huyện trực thuộc 19 tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ƣơng.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đƣợc tiến hành để tìm ra giải pháp chống lại
WSSV nhƣng kết quả thu đƣợc còn hạn chế, phần lớn là do chƣa hiểu biết rõ về cơ
chế lây nhiễm, nhân lên của virus trong tôm và hệ thống đáp ứng miễn dịch của tôm
chống lại virus này. Một hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới
hƣớng đến là tạo các vaccine dựa trên protein cấu trúc kháng nguyên vỏ của WSSV
nhƣ các protein VP28, VP26 của WSSV để kích thích đáp ứng miễn dịch ở tôm
chống lại bệnh đốm trắng. VP28 là một loại protein vỏ chính của WSSV đƣợc mã
hóa bởi gen wsv421 và có khối lƣợng phân tử khoảng 27,5 kDa, đóng vai trò chủ
đạo giúp virus gắn đặc hiệu lên tế bào tôm, là bƣớc khởi đầu cho quá trình lây
nhiễm. Chính vì vậy, VP28 là protein đƣợc lựa chọn để tạo kháng thể chẩn đoán
WSSV cũng nhƣ tạo vaccine cho tôm phòng bệnh đốm trắng. Tuy nhiên, những kết
quả nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh đốm trắng do WSSV cũng chỉ mới dừng lại
ở mức thử nghiệm nhỏ lẻ, chƣa tạo đƣợc một vaccine chính thức, hiệu quả.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tui đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân
dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên
VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” để tạo ra bào tử Bacillus subtilis biểu
hiện kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng làm cơ sở cho việc sản xuất
vaccine dạng probiotic bền nhiệt giúp phòng bệnh virus đốm trắng trên tôm.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Nhân dòng, xác định đƣợc trình tự và một số đặc trƣng của gen VP28 từ các
mẫu WSSV thu nhận đƣợc ở các địa bàn nuôi tôm chủ yếu của Việt Nam.
- Tạo đƣợc chủng B. subtilis tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa protein kháng
nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử.
- Bƣớc đầu đánh giá đƣợc khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân
trắng của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt.
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài:
Gen mã hóa protein VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Nhân dòng, xác định trình tự và một số đặc trƣng của gen vp28 từ các mẫu
WSSV thu nhận đƣợc ở Việt Nam
- Nghiên cứu biểu hiện gen vp28 trên bề mặt bào tử B. subtilis
- Nghiên cứu thử nghiệm khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân
trắng khi cho tôm ăn thức ăn trộn bào tử B. subtilis biểu hiện VP28.
4. Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện chủ yếu tại Phòng Thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội.
Phần thử nghiệm khả năng bảo hộ tôm thẻ chân trắng phòng bệnh virus đốm
trắng đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và
Protein với sự hỗ trợ, hợp tác của Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I.
5. Đóng góp mới của đề tài
- Đã xác định trình tự và một số đặc trƣng của gen vp28 từ các mẫu WSSV
thu nhận đƣợc ở Việt Nam và phát hiện ra 5 sự sai khác về nucleotide (A125G,
A183G, A226G, A403G, T517C) so với trình tự gen đã công bố (AY168644).
Trong số các sai khác về nucleotide, có 4 sai khác dẫn đến sự sai khác về acid amin.
- Đã tạo đƣợc chế phẩm bào tử B. subtilis tái tổ hợp với sự biểu hiện gen mã
hóa protein VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử B. subtilis dƣới dạng các cấu trúc
protein dung hợp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28, trong đó, CotB là protein vỏ của
B. subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhằm hạn chế
cản trở không gian đối với VP28.
- Đã tối ƣu đƣợc điều kiện thu nhận bào tử tái tổ hợp B. subtilis biểu hiện tốt
kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử và nghiên cứu các tính chất của
bào tử tái tổ hợp B. subtilis CotB-GST-VP28 trong một số điều kiện môi trƣờng
khác nhau.
- Đã đánh giá đƣợc sƣ̣ tăng ho ạt độ của các enzyme phenoloxidase (PO),
superoxide dismutase (SOD) có liên quan đến đáp ƣ́ ng miễn dịch của tôm và đánh
giá khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắng vớ i mƣ́ c bảo hô ̣trên
70% của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt.
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để tạo chế phẩm probiotic dạng bào
tử B. subtilis tái tổ hợp bền nhiệt, biểu hiện VP28 trên bền mặt, có khả năng tăng
cƣờng miễn dịch và bảo vệ tôm khỏi nhiễm bệnh đốm trắng, giúp góp phần kiểm
soát dịch bệnh trên tôm.
- Thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho việc phát triển các vaccine tái tổ hợp
dạng bào tử B. subtilis tái tổ hợp có khả năng phòng bệnh do các vi sinh vật khác
gây ra ở tôm.
H3Aa9T0WPzZKh8h
