BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH
VI SINH ỨNG DỤNG
Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương
1
- 2009 -
2
Giới thiệu môn học
Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương pháp phân lập, khảo
sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công nghệ lên men . Các vi sinh ứng
dụng thường được phân lập từ môi trường tự nhiên, chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác
nhau, chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực
vật hay thực phẩm. Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng
dụng.
Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi
trường đất. Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loại vi sinh
vật khác nhau. Số lượng vi sinh trong 1 g đất có tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào. Hoạt
động sống của vi sinh vật đất có liên quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các
vòng tuần hoàn của vật chất trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu
huỳnh.
Các bước chung của bài thực hành là
1. Phát hiện các nhóm vi sinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số nhóm phân loại
2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các đại diện
thuộc vi sinh vật phân lập được.
NỘI DUNG THỰC HÀNH
BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA
BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA
BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA

1. Môi trường - hóa chất
Môi trường canh thịt- peptone:
Cao thịt 5g
Peptone 10g
Nước 1000ml
Môi trường thạch:
Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch.
4
Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng.
Giấy lọc loại thấm acetate chì
Giấy quỳ đỏ
Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử,
Thuốc thử Nessler
2. Dụng cụ
Các dụng cụ pha chế môi trường
Các dụng cụ cấy, khử trùng
Kinh hiển vi
3. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường:
Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở
1 atm, 15 min.
Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng ở 0,5
atm.
Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ
ở 30
O
C
Chuẩn bị mẫu:
Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù
• Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng:

Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm
một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa:
Màu vàng nhạt – ít ammoniac
Vàng sậm – nhiều ammoniac
Nâu – rất nhiều ammoniac
Sự sinh NH
3
làm giấy quỳ hóa xanh
Sự sinh H
2
S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen.
So sánh đối chứng và thí nghiệm.
Độ pha
loãng
Đục môi
trường
Tạo bông Tạo cặn Sinh NH
3
Sinh H
2
S
Nhận xét mức độ, tỷ lệ xuất hiện cao nhất trong 1g mẫu
Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ vi sinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi
Trên môi trường thạch, ghi nhận:
Số lượng khuẩn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng
Số khuẩn lạc đặc trưng
Quan sát hình thái khuẩn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng
Độ pha
loãng
Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc

không di động.
Giai đoạn 2 của quá trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat bởi một số vi khuẩn:
Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis.
Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt
đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện không thuận lợi chúng có
thể hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ,
thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặ trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn
keo. Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao.
Vi khuẩn nitrat hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với
việc oxi hóa cơ chất-NH
3
và nitrit
II. Thực hành
Việc phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóa được thực hiện bằng cách cấy dịch
huyền phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong môi
trường này là CO
2
có trong không khí và trong thành phần của CaCO
3
. Nguyên liệu năng lượng và
nguồn N cho các vi khuẩn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrat hóa là NH
3
và muối amon, còn
đối với vi khuẩn gây ra giai đoạn hai là nitrit.
7
Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là việc thông khí đầy đủ vào
môi trường nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn nitrat hóa được xác định bằng phương pháp pha loãng tới
hạn.
1. Môi trường- hóa chất
Thành phần môi trường Winogradski:

Ủ ở 28-30
O
C trong 2-3 tuần
Làm 1 ống nghiệm đối chứng
3. Quan sát và ghi nhận kết quả:
Ở mỗi độ pha loãng, ghi nhận sự thay đổi môi trường trong ống nghiệm
Những ống nghiệm nào ghi nhận có vi khuẩn phát triển, cần tiến hành thử nghiệm định tính.
Phản ứng định tính nitrat: Lấy vài tinh thể diphenylamin hòa tan trong 1 giọt H
2
SO
4
đậm đặc. Sau
đó thêm 1 giọt dịch cần kiểm tra. Tiến hành trên bản sứ trắng sẽ thấy xuất hiện màu xanh thẩm.
Ghi nhận kết quả vào bảng
Ống nghiệm
số
Độ pha loãng
10
2
10
3
10
4
10
5
NO
2-
NO
3-
NO

hoạt động sống của mình.
Quá trình phản nitrat hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng đặc biệt mạnh
trong điều kiện kỵ khí.
Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn chúng
thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống Pseudomonas,
Achromobacter, Micrococcus …
II. Thực hành
Việc phát hiện vi khuẩn phản nitrat hóa và xác định số lượng của chúng được thực hiện bằng
phương pháp cấy mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrat và các hợp chất
khác cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Khi đó, đáng chú ý là một số vi khuẩn nitrat sử
dụng nitrat như nguồn năng lượng chủ yếu hoặc duy nhất, tức dùng chúng làm chất nhận electron
nhưng không dùng làm nguồn N trong trao đổi kiến tạo, vì không thể khử NH3 thành NH4
+
. Vì vậy,
trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn phản nitrat hóa, người ta cho thêm peptone, asparagin hoặc
muối amon và hạn chế lưu khí trong quá trình nuôi cấy.
Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
1. Môi trường- hóa chất
Môi trường Giltay:
Dung dịch A:
Asparagine: 1g
KNO
3
: 1g
Nước máy: 0.25l
Dung dịch B:
KNO
3
: 8,5g
K

3. Quan sát và ghi nhận kết quả
Dấu hiệu chủ yếu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là sự sinh khí, làm đục và giảm pH
của môi trường
Quan sát các ống nghiệm ở các độ pha loãng khác nhau và ghi nhận vào bảng
Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin
Độ pha loãng Đục môi trường Sinh khí pH môi trường NO
3
-
10
3
10
5
10
7
10
9
Chọn 1 ống nghiệm cho kết quả tốt nhất làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi và ghi nhận hình thái
học của các vi khuẩn phản nitrat hóa phân lập được.
Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin:
Lấy vài tinh thể diphenylamine hòa tan vào một giọt H2SO 4 đặc, sau đó thêm vào một giọt dịch
nghiên cứu. Nếu có mặt nitrate sẽ xuất hiện màu xanh thẫm.
11
BÀI 4. VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITƠ
I. Lý thuyết
Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vi sinh vật và dùng làm nguồn kiến tạo tế
bào. Các vi sinh vật cố định N sống tự do, có nhiều trong đất, nước gồm một số loài thuộc giống
Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, vi khuẩn quan năng, vi khuẩn sinh
metan, vi khuẩn khử sulfat, nấm, tảo lam… Ngoài ra khả năng cố định N còn có ở các vi khuẩn nốt
sần sống cộng sinh trong rễ các cây họ đậu. Chúng có ý nghĩa quan trong trong việc chuyển N vô cơ
thành N hữu cơ, đặc biệt là vai trò của vi khuẩn nốt sần, các loài trong giống Clostridium và

Azotobacter cần độ ẩm cao hơn so với nhiều vi khuẩn khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất
khô hạn.
Việc phát hiện Azotobacter được thực hiện trên môi trường chọn lọc Thompson-Sherman không
chứa nitrogen hợp chất, trong điều kiện hiếu khí và độ ẩm cao.
1. Môi trường- hóa chất
Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N
2
-free glucose) tăng sinh
K
2
HPO
4
: 1g
MgSO
4:
0,2g
FeSO
4
: 0,2g
CaCl
2
: 0,1g
Na2MoO4: 0,001g
Glucose: 10g
Nước máy: 1000ml
Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N
2
-free glucose) phân lập
K
2

3. Quan sát ghi nhận kết quả
Quan sát và ghi nhận hình thái vi khuẩn đặc trưng sau giai đoạn tăng sinh.
Hình
dạng
tế bào
Bào tử Kích
thước
Sự sắp
xếp tế
bào
Có roi Di động Bao
nhầy
Hình
vẽ tế
bào
Loại 1
Loại 2
Ghi nhận các loại khuẩn lạc khác nhau xuất hiện sau giai đoạn phân lập. Mô tả các khuẩn lạc đó
Khuẩn
lạc loại
Hình
dạng
Bề mặt Độ trong Màu sắc Huỳnh
quang
Khuếch tán
màu vào
môi trường
Số lượng
khuẩn lạc loại
này

lượng.
Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm niêm khuẩn, một số
đại diện của các vi khuẩn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuẩn, nấm Trong đó, quan trọng
nhất là niêm khuẩn.
Niêm khuẩn có tế bào hình que nhỏ bé (03-0,4 x 0,7-10μm) hơi uốn cong, thường có đầu nhọn,
thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuẩn khác. Trên cơ chất đặc niêm khuẩn
có chuyển động trượt, do sự tiết chất nhầy không đồng đều trên bề mặt tế bào. Vài loài niêm khuẩn
có tiên mao, có chu kỳ phát triển phức tạp. Đầu tiên, các tế bào hình que từ từ dầy lên, biến thành
những tế bào dạng nghỉ, hình cầu hoặc bầu dục, kích thước khác nhau.
Niêm khuẩn phân giải cellulose chủ yếu gồm các giống Cytophaga, Sporocytophaga,
Sorangium sống trong đất ít acid, trung tính và ít kiềm. Các loài thuộc giống Cytophaga có tế bào
đầu nhọn, không sinh vi kén. Các loài trong giống Sporocytophaga có hình thái tương tự như
Cytophaga nhưng khác ở chỗ có khả năng sinh vi kén. Các loài thuộc giống Sorangium là những
trực khuẩn đầu nhọn, có khả năng hình thành kén.
Trên bề mặt vật liệu có cellulose, niêm khuẩn phát triển trong dạng thể nhầy, không có hình
dạng xác định, lan rộng, không màu hoặc có màu vàng, da cam, đỏ tương ứng với chỗ cellulose bị
phân giải nhiều hay ít.
Ngoài niêm khuẩn, trong đất còn có các loài phân giải cellulose thuộc giống Cellvibrio, tế bào
uống cong, di động nhờ 1 tiên mao, không sinh nội bào tử, khuẩn lạc không màu hoặc có màu vàng
lục. Chúng chỉ dùng cellulose khi cạn kiệt các nguồn cacbon khác và khả năng phân giải không
mạnh mẽ bằng niêm khuẩn.
Trong đất chua, vai trò phân giải do các nấm thuộc giống Chaelomium, Trichoderma, Fusarium,
Aspergillus
II. Thực hành
Hầu hết tất cả những loài phân giải cellulose thuộc nhóm hiếu khí và ưa ẩm.
15
Việc phát hiện và xác định sô lượng các vi sinh vật phân giải cellulose trong điều kiện hiếu khí
được tiến hành bằng cách cấy dịch huyền phù nghiên cứu lên các đĩa chứa môi trường chọn lọc
Hutchinson có nguồn cacbon duy nhất là xellulose. Nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí.
1. Môi trường và hóa chất

Hình dạng Kích thước Màu sắc Mức độ phân
giải cellulose
Số khuẩn lạc cùng
loại ghi nhận được
(khuẩn lạc/đĩa)
Loại 1
Loại 2
16
Mô tả khác khuẩn lạc khác nhau của niêm khuẩn, ghi nhận các dấu hiệu. Chọn khuẩn lạc đặc trưng
nhất làm tiêu bản cùng với các sợi cellulose từ những chỗ giấy lọc bị phân giải nhiều nhất. Lưu ý
hình dạng tế bào sinh dưỡng và vi kén hoặc bào tử nấm mốc
Khuẩn lạc loại Tế bào sinh
dưỡng
Vi kén Hình vẽ tế bào Hình vẽ vi kén
(nếu có)
Loại 1
Loại 2
17