Bài 5 Cổ khuẩn(Archaea)
Phân loại cổ khuẩn
Mở đầu
Những vi sinh vật có khả năng sinh methane (mêtan), mẫn cảm với
oxygen và có cấu trúc màng tế bào đặc biệt đã được biết đến từ lâu
nhưng mãi đến cuối những năm 1970 chúng mới được nhìn nhận như
đại diện của một dạng sống thứ ba trên trái đất bên cạnh vi khuẩn và
sinh vật nhân thật, đó là cổ khuẩn. Carl R. Woese và cộng sự (1977)
sau khi xem xét trình tự 16S rARN nhận thấy rằng các sinh vật nhân
nguyên thuỷ (Prokaryote) cần được chia thành hai nhóm khác biệt
nhau hoàn toàn là Vi khuẩn (Eubacteria hay Bacteria) và Cổ khuẩn
(Archaeabacteria hay Archaea), và cùng với các Sinh vật nhân thật
(Eukarya) làm thành ba lĩnh giới (Domains) ở sinh vật (Hình 1). Các
nghiên cứu sâu hơn về phả hệ và đặc điểm sinh lý sinh hoá cho thấy
rằng cổ khuẩn được tách ra từ rất sớm trong quá trình tiến hoá, chúng
không gần vi khuẩn nhiều hơn so với sinh vật nhân thật, do vậy tên
gọi Archaea được đề xuất thay cho Archaeabacteria. Hiện nay cả hai
tên gọi Archaea và Archaeabacteria đều được sử dụng trong các tài liệu vi sinh vật, tuy nhiên thuật
ngữ Archaea chính xác hơn vì rõ ràng cổ khuẩn không phải vi khuẩn mà là một nhóm vi sinh vật
riêng biệt.

Hình 1. Ba lĩnh giới của sinh vật: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và Sinh vật nhân thật
(Eukarya).
Cổ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đặc biệt
Cổ khuẩn (Archaea) bắt nguồn từ tiếng La tinh Archaios có nghĩa là cổ, là một nhóm vi sinh vật có
nhiều đặc điểm rất khác biệt (Bảng 1).
Bảng 1. Những đặc điểm khác biệt của cổ khuẩn so với vi khuẩn và sinh vật nhân thật
Đặc điểm
Vi khuẩn
(Bacteria)
Cổ khuẩn(Archaea)


Cũng như tế bào vi khuẩn, tế bào cổ khuẩn (ngoại trừ chi Thermoplasma) có thành tế bào
bên ngoài giữ chức năng bảo vệ. Tuy nhiên, không như ở vi khuẩn, thành tế bào của cổ khuẩn
không chứa peptidoglycan và vì thế không bị phá huỷ dưới tác dụng của lysozym. Cổ khuẩn có rất
nhiều dạng cấu trúc thành tế bào khác nhau. Một số cổ khuẩn (như các loài sinh methane) có thành
tế bào cấu tạo bởi một loại polysaccharid rất giống với peptidoglycan được gọi là pseudo-
peptidoglycan (pseudomurein). Chuỗi pseudo-peptidoglycan gồm các đơn nguyên N-acetyl-
glucosamin và N-acetyl-alosamin-uronic acid (thay cho N-acetyl-muramic acid trong
peptidoglycan). Ngoài ra, ở đây cầu nối glycosid 13 thay thế cho cầu nối glycosid 14 ở
peptidoglycan. Một số cổ khuẩn khác lại hoàn toàn không có cả peptidoglycan và pseudo-
peptidoglycan trong thành tế bào mà thay vào đó là hỗn hợp gồm polysaccharid, glycoprotein hoặc
protein. Ví dụ như các loài Methanosarcina (cổ khuẩn sinh methane) có thành tế bào là một lớp
polysaccharid dày cấu tạo từ glucoza, glucuronic acid, galactosamin và acetat. Các loài cổ khuẩn ưa
mặn cực đoan (extreme halophiles) như là Halococcus có thành tế bào tương tự như
Methanosarcina nhưng chứa nhiều hợp chất có nhóm sulfat giống như chondroitin sulfat ở tổ chức
liên kết của động vật. Dạng cấu trúc thành tế bào phổ biến nhất ở cổ khuẩn là lớp paracrystallin bề
mặt (S-layer) gồm protein hay glycoprotein. Cấu trúc này được tìm thấy ở các đại diện thuộc tất cả
các nhóm cổ khuẩn, từ ưa mặn cực đoan (extremely halophilic), ưa nhiệt cực đoan (extremely
thermophilic) và cả các loài sinh methane. Đặc biệt các chi Methanospirillum và Methanothrix (cổ
khuẩn sinh methane) có cấu trúc thành tế bào vô cùng phức tạp. Các loài thuộc hai chi này mọc
thành chuỗi dài gồm nhiều tế bào, ở giữa mỗi cặp tế bào có một lớp đệm dày và toàn bộ cấu trúc
chuỗi đó lại được bọc kín trong một lớp paracrystallin bề mặt.

Thành phần và cấu trúc lipid của màng tế
bào là một trong những đặc điểm nổi bật phân biệt
cổ khuẩn và hai nhóm còn lại. Trong khi ở vi khuẩn
và sinh vật nhân thật cầu nối acid béoglycerol
trong lipid màng tế bào là liên kết este (ester) thì ở
cổ khuẩn lại là liên kết ete (ether) (Hình 2). Acid
béo trong este-lipid thường là các phân tử ngắn,

Với những điểm khác biệt trong trình tự 16S rARN cũng như cấu trúc ARN-polymeraza,
hiển nhiên bộ máy sinh tổng hợp protein của ba lĩnh giới sinh vật cũng sẽ không đồng nhất. Tuy có
kích thước của ribosom giống với vi khuẩn (70S) nhưng cổ khuẩn lại có nhiều bước trong quá trình
sinh tổng hợp protein rất giống với sinh vật nhân thật (80S ribosom). Nhiều chất kháng sinh ức chế
quá trình sinh tổng hợp protein ở vi khuẩn lại không có hiệu lực đối với cổ khuẩn và sinh vật nhân
thật (Bảng 2). Ngoài ra, tương tự như ở sinh vật nhân thật, nhân tố kéo dài EF-2 trong ribosom ở cổ
khuẩn có phản ứng với độc tố bạch hầu, một loại độc tố vô hại đối với vi khuẩn. Tuy nhiên nhân tố
EF-2 ở cổ khuẩn mang tính đặc hiệu cao, nhân tố này hoàn toàn không hoạt động trong môi trường
ribosom của vi khuẩn hoặc sinh vật nhân thật. Các thí nghiệm lai ribosom in vitro cho thấy ribosom
ghép giữa đơn vị lớn (50S) của cổ khuẩn và đơn vị nhỏ (40S) của sinh vật nhân thật vẫn thức hiện
chức năng giải mã một cách bình thường, trong khi đó việc ghép tương tự giữa vi khuẩn và sinh vật
nhân thật lại hoàn toàn không tương thích. Như vậy cấu trúc bộ máy sinh tổng hợp protein của cổ
khuẩn có nhiều điểm tương đồng với sinh vật nhân thật hơn là với vi khuẩn.

Hình 2. Lipid trong màng tế bào của cổ
khuẩn (ete-lipid) khác với của vi khuẩn và
sinh vật nhân thật (este-lipid)
Giống như vi khuẩn, cổ khuẩn có một nhiễm sắc thể dạng vòng, tuy nhiên genom của cổ
khuẩn thường nhỏ hơn nhiều so với genom của vi khuẩn. Chẳng hạn ADN của Escherichia coli là
2,5 x 10
9
Da, trong khi đó ADN của Thermoplasma acidophilum là 0,8 x 10
9
Da, hay của
Methanobacterium là 1,1 x 10
9
Da. Ngoài ra thành phần GC (mol%) của ADN ở cổ khuẩn dao động
trong phạm vi rất lớn, từ 21 đến 68 %, chứng tỏ tính đa dạng của cổ khuẩn. So sánh trình tự đầy đủ
của genom ở cổ khuẩn Methanococcus jannaschi với genom của vi khuẩn và sinh vật nhân thật cho
thấy 56% trong 1738 gen không tương đồng.


+

Neomycin,
puromycin
Dừng tổng hợp
sớm
+
+
+
+
Rifamycin
Ức chế enzyme
ARN polymeraza


+

Erythromycin,
streptomycin,
chloramfenicol
Tăng tần số mắc
lỗi và một số hiệu
ứng khác


+


Các hình thức dinh dưỡng ở cổ khuẩn

ngược, tương tự như ở vi khuẩn lam lưu huỳnh. Mặc dù các loài cổ khuẩn ưa nhiệt cực đoan đều
thực hiện hình thức dinh dưỡng hữu cơ nhưng nhiều loài vẫn có khả năng cố định CO
2
và thực hiện
quá trình này theo chu trình Calvin, tương tự như ở vi khuẩn và sinh vật nhân thật.
Khả năng quang hợp có ở một số loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan, tuy nhiên khác với vi khuẩn,
quá trình này được thực hiện hoàn toàn không có sự tham gia của chlorophill hay
bacteriochlorophill mà nhờ một loại protein ở màng tế bào là bacteriorhodopsin kết gắn với phân tử
tương tự như carotenoid có khả năng hấp phụ ánh sáng, xúc tác cho quá trình chuyển proton qua
màng nguyên sinh chất và sử dụng để tổng hợp ATP. Tuy nhiên, bằng hình thức quang hợp này cổ
khuẩn ưa mặn cực đoan chỉ có thể sinh trưởng với tốc độ thấp trong điều kiện kỵ khí, khi môi
trường thiếu chất dinh dưỡng hữu cơ.

Môi trường sống của cổ khuẩn và giả thuyết về hình thành sự
sống trên trái đất
Cổ khuẩn được biết đến như những vi sinh vật thích nghi với các môi trường có điều kiện cực đoan
(extreme) như nhiệt độ cao (thermophilic), nơi lạnh giá (psychrophilic), nồng độ muối cao
(halophilic) hay độ acid cao (acidophilic) v.v. Đó cũng là một lý do giải thích tại sao cổ khuẩn lại
khó được phân lập và nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Trong giới sinh vật, cổ khuẩn có
các đại diện cư trú ở các điều kiện nhiệt độ cao hơn cả (Bảng 3, Hình 3), nhiều loài có thể sống ở
nhiệt độ trên 100 C dưới áp suất cao như ở các miệng núi lửa dưới đáy đại dương. Cơ chế thích
nghi của tế bào vi sinh vật với nhiệt độ cao như vậy còn đang được nghiên cứu. Ở cổ khuẩn, một số
phương thức thích nghi với nhiệt độ cao được biết đến như tác dụng của enzyme gyraza trong việc
bảo vệ cấu trúc xoắn của ADN dưới tác động của nhiệt, hay ete-lipid, nhất là C
40
-lipid trong màng
tế bào của cổ khuẩn, giúp làm tăng đô bền vững của màng. Tuy nhiên cổ khuẩn không chỉ sống ở
các môi trường cực đoan. Ngoài đại dương cổ khuẩn tồn tại với một số lượng lớn. Trên đất liền các
loài cổ khuẩn sinh methane ưa ấm có mặt ở nhiều môi trường khác nhau, như các bể lên men chất
thải hữu cơ, các chân ruộng lúa ngập nước, đường tiêu hoá của động vật v.v.

rõ nhất, bao gồm nhiều loài sinh methane, cổ khuẩn ưa mặn, khử sulfat (Archaeoglobales),
Thermoplasmalates và Thermococcales. Nhóm Crenarchaeota gồm ba lớp Desulfococcales,
Sulfolobales và Thermoproteales. Sau này nhóm cổ khuẩn Korarchaeota được đề xuất thêm (Hình
6), tuy nhiên chỉ dựa trên các trình tự 16S rADN có được từ các mẫu ADN tách trực tiếp từ môi
trường chứ chưa có đại diện nào được phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.
Hình 4. Các đại diện của hai nhóm cổ khuẩn Crenarchaeota và Euryarchaeota.

Hình 5. Hình thái một số đại diện của hai nhóm cổ khuẩn Euryarchaeota và Crenarchaeota
Hình 6 Mối liên quan phả hệ của ba nhóm cổ
khuẩn Euryarchaeota và Crenarchaeota và
Korarchaeota
Hình 7 Nanoarchaeum equitans (cầu
khuẩn nhỏ) trên bề mặt Ignicoccus sp.
(cầu khuẩn lớn)

Gần đây (2002), nhóm nghiên cứu của giáo sư Stetter, một trong những nhà nghiên cứu cổ
khuẩn hàng đầu thế giới, công bố sự hiện diện của nhóm cổ khuẩn thứ tư, Nanoarchaeota, gồm
những cổ khuẩn có kích thước rất nhỏ với một đại diện duy nhất được tìm thấy là Nanoarchaeum
equitans (Hình 7). Loài cổ khuẩn này có tế bào hình cầu, đường kính 400 nm, sống bám trên bề mặt
tế bào của một loài cổ khuẩn mới Ignicoccus sp., phân lập từ mẫu nước nóng ở độ sâu 106 m dưới
đáy biển. Đây là một loài ưa nhiệt cực đoan, phát triển ở nhiệt độ tối ưu 75-98 C. Nhiều trình tự
16S rARDN trực tiếp có được từ môi trường có nhiệt độ cao cũng khẳng định sự tồn tại và khác biệt
của nhóm Nanoarchaeota so với các nhóm cổ khuẩn còn lại.


6
+
6 O
2
 6 CO
2
+ 6 H
2
O (∆G
0
’ = 2870 kJ/mol). Là những sinh vật duy nhất có khả năng tạo ra khí
methane, cổ khuẩn sinh methane có những enzyme và coenzyme thiết yếu cho quá trình tổng hợp
methane và đóng vai trò chỉ thị cho nhóm, ví dụ như coenzyme F
420
và coenzyme M. Sự hiện diện
của coenzyme F
420
khiến cho các tế bào của cổ khuẩn sinh methane có tính tự phát sáng dưới ánh
đèn huỳnh quang (bước sóng 350420 nm). Mặc dù hiện tượng tự phát sáng này có thể mạnh, yếu,
hay đôi khi mất hẳn, tuỳ thuộc vào các pha sinh trưởng của tế bào, nhưng đó vẫn là một đặc điểm
đơn giản và tiện lợi để nhận biết cổ khuẩn sinh methane dưới kính hiển vi. Bên cạnh đó, trình tự
acid amin trong các chuỗi peptid của coenzyme M cũng được dùng để phân loại cổ khuẩn sinh
methane. Những nghiên cứu trong lĩnh vực này cho thấy sự tương đồng giữa cây phân loại dựa trên
trình tự 16S rARN và cây phân loại dựa trên trình tự acid amin của các đơn vị  và  trong
coenzyme M.

Bảng 4. Phản ứng tạo methane trên các cơ chất khác nhau và năng lượng được giải phóng từ
đó
Phản ứng sinh methane
Năng lượng được giải

2
 CH
4
+ 2 Acetat
116,3
Metanol + H
2
 CH
4
+ H
2
O
112,5
4 Metanol  3CH
4
+ CO
2
+ 2H
2
O
104,9
4 Methylamin + 2H
2
O  3CH
4
+ CO
2
+ 4NH
4
+

+ H
2
S
 73,8
Acetat  CH
4
+ CO
2

 31,0
Những nơi thông thường có thể tìm thấy cổ khuẩn sinh methane là các bể lên men hữu cơ kỵ
khí, các lớp trầm tích thiếu oxygen, đất ngập úng và hệ đường ruột của động vật. Khi ở dạng chủng
đơn cổ khuẩn sinh methane rất nhạy cảm với oxygen, tuy vậy trong tự nhiên chúng có thể tồn tại ở
môi trường hiếu khí nhờ được bao bọc và bảo vệ bởi các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí khác. Trong
môi trường kỵ khí, cổ khuẩn sinh methane phải cạnh tranh về cơ chất, đặc biệt là hydro và acetat,
với các nhóm vi sinh vật sử dụng chất nhận điện tử có hiệu điện thế khử dương tính hơn so với CO
2

như là nitơrat, sulfat và ôxit sắt III. Như vậy cổ khuẩn sinh methane sẽ chiễm lĩnh các môi trường
nơi không có nhiều các loại chất nhận điện tử tiềm năng này. Do không có khả năng sử dụng rộng
rãi các loại cơ chất khác nhau, trong tự nhiên cổ khuẩn sinh methane thường phải phụ thuộc vào các
loài vi khuẩn lên men vì chúng chuyển hoá đa dạng chất hữu cơ thành các acid hữu cơ, hydro,
format và acetate, trong đó hydro, format và acetate là nguồn thức ăn trực tiếp cho cổ khuẩn sinh
methane, còn các acid hữu cơ sản phẩm của quá trình lên men như propyonat, butyrate thì cần phải
được một nhóm vi khuẩn khác chuyển hoá thành cơ chất thích hợp rồi mới đến lượt cổ khuẩn
chuyển thành khí methane. Có hai hình thức cộng sinh: bắt buộc và không bắt buộc. Trong hình
thức cộng sinh giữa cổ khuẩn sinh methane và vi khuẩn lên men, chỉ có cổ khuẩn phụ thuộc vào
mối liên hệ này do nhu cầu về thức ăn còn các hoạt động trao đổi chất của chúng hoàn toàn không
có ảnh hưởng gì tới các vi khuẩn lên men, vì thế hình thức này được gọi là cộng sinh không bắt
buộc.

sẽ cần phải thay đổi.

Bảng 5. Các nhóm phân loại chính của cổ khuẩn sinh methane
Lớp
Họ
Chi
Methanobacteriales
Methanobacteriaceae (T)
Methanobacterium (T)

Hình 9 : Cộng sinh giữa Methanobrevibacter (tế
bào trực khuẩn) và Synthrophobacter (tế bào hình
oval).
-nt-
-nt-
Methanobrevibacter
-nt-
-nt-
Methanosphaera
-nt-
Methanothermaceae
Methanothermus (T)
Methanococcales
Methanococcaeae (T)
Methanococcus (T)
Methanomicrobiales
Methanosarcinaceae
Halomethanococcus
-nt-
-nt-

-nt-
Methanoplanus
-nt-
-nt-
Methanospirillum
-nt-
Methanocorpusculaceae
Methanocorpusculum (T)
T = họ/ chi chuẩn; -nt- như trên
Về hình thái, cổ khuẩn sinh methane rất đa dạng, trong đó một số loài có hình dạng đặc
trưng dễ nhận biết dưới kính hiển vi như Methanosarcina, Methanospirillum hay Methanosaeta
(Hình 10). Ngoài ra, một trong những đặc điểm quan trọng dùng để phân loại nhóm cổ khuẩn này là
nguồn cơ chất có thể sử dụng để sinh methane (Bảng 6).
Họ Methanobacteriaceae có thành tế bào cấu tạo từ pseudomurein, vì thế bắt mầu Gram (+). Họ
Methanobacteriaceae gồm có ba chi là Methanobacterium, Methanobrevibacter và
Methanosphaera. Các loài thuộc chi Methanobacterium có tế bào hình que hoặc hình sợi, đôi khi
tạo nhóm gồm nhiều tế bào. Tất cả các loài thuộc chi này đều có khả năng sinh methane từ H
2
+
CO
2
, một số loài sử dụng.
Bài 6 Phương pháp thực nghiệm dùng để định tên các loài vi
khuẩn
1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI:
1.1. Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)
Vật liệu, hoá chất:
 Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):
2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95%
0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất

3
1,5 g
Formalin 2 ml
NaOH 1% 1 ml
Nước cất 100 ml
 Dung dịch B: 2 g AgNO
3
hoà tan trong 100 ml nước cất, lấy 10 ml dể riêng. Nhỏ
dung dịch NH
4
OH đậm đặc vào 90 ml

còn lại, thấy hình thành tủa rất đặc, tiếp tục
nhỏ NH
4
OH vào cho đến khi tan hết tủa. Lấy 10ml AgNO
3
đã bỏ ra ban đầu nhỏ từ
từ vào dung dịch, thấy xuất hiện váng mỏng, tiếp tục nhỏ vào cho đến khi vừa tan
hết váng thì thôi.
 Chuẩn bị phiến kính: rửa thật sạch, ngâm trong cồn, đốt cháy hết cồn rồi mới sử
dụng.
Các bước tiến hành:
 Hoạt hoá vi khuẩn 2-3 lần trước khi tiến hành nhuộm.
 Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ mặt thạch (mới cấy 18-24 giờ) hoà vào 1
giọt nước cất đặt giữa phiến kính, để nghiêng cho chảy về một phía, làm khô trong
không khí.
 Cố định tế bào: hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
 Nhỏ dịch A lên vết bôi, giữ 10 phút, rửa bằng nước cất.
 Dùng dịch B cho chảy qua để loại hết nước. Nhuộm bằng dịch B trong 30-60 giây.

Kết quả:
Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ.
Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục
1.4.2. Nhuộm Carbolic Fuchsin
Vật liệu, hoá chất:
 Dung dịch A:
10 ml dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong etanol (khoảng 10%)
100 ml dung dịch acid carbolic (phenol) 5% (trong nước).
Trộn đều với nhau (chuẩn bị trước khi dùng)
 Dung dịch B:
100 ml Etanol 95%
3 ml HCl đậm đặc
 Dung dịch C:
30 ml dung dịch Xanh metylen (Methylene blue) bão hoà trong etanol (khoảng 2%)
100 ml dung dịch KOH 0,01% trong nước.
Trộn đều với nhau, để càng lâu càng tốt.
Các bước tiến hành:
 Làm vết bôi trên phiến kính, cố định tế bào.
 Nhỏ dung dịch A lên vết bôi, hơ nóng nhẹ bên dưới để bay hơi, tránh để sôi. Thêm
dần dần thuốc nhuộm để không bị khô cạn, giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ thuốc nhuộm
đi.
 Dùng dịch B rửa cho đến khi vừa thấy vừa hết màu đỏ, rửa nước.
 Nhuộm lại bằng dung dịch B trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khô.
 Soi kính: dùng vật kính dầu.
Kết quả:
Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh

Hình 1.3. Các bước tiến hành nhuộm Carbolic Fuchsin và ví dụ minh hoạ kết quả.

1.5. Nhuộm vỏ nhầy (Capsule)

Kết quả:
Nền vi trường màu xanh, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy không màu
1.5.3. Phương pháp nhuộm âm bản đơn giản (Hình 1.4):
 Nhỏ 1 giọt Nigrosin vào đầu một phiến kính sạch.
 Lấy 1 vòng que cấy vi khuẩn trộn với giọt nigrosin.
 Lấy một phiến kính khác để nghiêng 45
0
và kéo giọt nigrosin đã trộn vi khuẩn về phía
phải một chút sau đó kéo nhẹ về phía trái để dàn mỏng thành một vết bôi. Để khô tự
nhiên (không hơ lửa).
 Quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy vỏ nhầy màu sáng nổi lên trên một nền màu đen. Hình 1.4. Nhuộm âm bản dùng Nigrosin và ví dụ minh hoạ kết quả.

1.5.4. Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
Vật liệu, hoá chất:
 Dung dịch Tím kết tinh 1% trong nước
 Dung dịch Sulfat đồng CuSO
4
20% trong nước
Các bước tiến hành:
 Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh lên phiến kính sạch
 Lấy vi khuẩn từ ống thạch nghiêng (48 giờ) trộn với dung dịch tím kết tinh, dùng cạnh
lam kính dàn đều trên toàn bộ phiến kính để làm vết bôi, giữ trong không khí 5-7 phút để
làm khô, không được hơ nóng.
 Rửa vết bôi bằng dung dịch sulfat đồng 20%, thấm khô.
 Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:
 Tế bào có màu sẫm, vỏ nhày màu nhạt ở xung quanh.

Vật liệu, hoá chất:
 Dung dịch A: Đen Sudan B (Sudan black B) 0,3 g
Etanol 70% 100 ml.
Trộn đều, lắc mạnh, để qua đêm mới sử dụng.
 Dung dịch B: Xylene
 Dung dịch C: Dung dịch Safranin 0,5% trong nước.
Các bước tiến hành:
 Làm vết bôi, cố định vết bôi.
 Nhuộm bằng dịch A trong 10 phút, rửa nước, thấm khô.
 Dùng dịch B rửa cho đến khi mất màu.
 Nhuộm bằng dịch C trong 1-2 phút, rửa nước, thấm khô.
 Soi kính: dùng vật kính dầu 100
Kết quả:
Hạt PHB bắt màu lam đen. Tế bào và các bộ phận khác có màu đỏ.
1.9. Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis)
Vật liệu, hoá chất:
 Dung dịch nhuộm:
1 ml dung dịch Fuchsin bão hoà bão hoà (xem nhuộm carbolic fuchsin) trộn với 100 ml
dung dịch acid carbolic 5% trong nước.
Khi dùng pha loãng 10 lần.
Các bước tiến hành:
 Làm vết bôi, cố định vết bôi
 Nhuộm trong 1 phút, rửa nước, hong khô
 Soi kính: dùng vật kính dầu
Kết quả:
Tinh thể bắt màu đỏ. Bào tử tách rời có vòng màu đỏ
1.10. Nhuộm vi khuẩn kháng acid
Vật liệu, hoá chất:
 Dung dịch A:
Dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong nước ( 10%) 10 ml

C
để làm khô mặt thạch.
 Lấy một vòng que cấy gạt 3-4 lần trên mặt thạch ở một góc. Quay đĩa thạch sang hướng
khác và ria cấy từ một vạch thành 3-4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước.
Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa phần vi khuẩn dính trên que cấy. Chú ý
không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy.