Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
1
BÀI MỞ ĐẦU: MÔ PHỎNG THÍ NGHIỆM

1. Mô phỏng điện di protein trên điện di đứng.
2. Mô phỏng điện di protein bằng phương pháp điện di 2 chiều.
3. Mô phỏng các phương pháp lai.

BÀI 1: CHIẾT TÁCH ADN TỪ TẾ BÀO LÁ NON

1. Vật liệu và hóa chất
1.1 Vật liệu sinh học
Lá non
1.2 Hóa chất
Dung dịch đệm 1.5 CTAB (Cetyltrimethyllammonium bromide)
1.5% CTAB
75mM Tris-HCL
15mM EDTA
1.05M NaCl
Đệm kết tủa CTAB
1% CTAB
50mM Tris-HCL
10mM EDTA
Đệm TE
10mM Tris-HCl
1mM EDTA
Đá khô
Nitơ lỏng
Chloroform: isoamylalcohol (24:1)
10mg/ml RNase
99.5% , 70% ethanol

Sau khi phá bỏ màng tế bào và nhân thì dùng dung dịch đệm CTAB để
hòa tan ADN. Nhưng trong dịch chiết có lẫn protein và ARN nên để thu nhận
được ADN tinh sạch ta phải tiến hành bước loại bỏ protein và ARN. Ở đây
thường dùng phenol, chloroform và isoamylalcohol. Phenol có tác dụng làm
biến tính protein và không hòa tan nucleic acid. Chloroform cũng có tác dụng
làm biến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol ra
khỏ
i phần dung dịch có chứa ADN. Isoamylalcohol có tác dụng ổn định giữa
hai pha nước và pha chloroform.

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
3
3.3 Kết tủa CTAB và ADN
Để loại bỏ CTAB thì cần phải kết tủa CTAB và ADN rồi sau đó hòa tan
ADN trong dung dịch NaCl mà tủa CTAB không tan trong dung dịch này.
3.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch ADN
Sau khi loại bỏ CTAB bằng dung dịch HCl 1M, ta tiến hành kết tủa ADN
bằng etanol nguyên chất lạnh, để tăng khả năng kết tủa ta có thể pha thêm
dung dịch muối CH
3
COONa 3M (2 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần
tủa, 0.1 thể tích dung dịch muối/ thể tích dung dịch cần tủa. Ngoài ra còn có
thể tủa bằng isopropanol (0.8-1 thể tích Isopropanol/ thể tích dung dịch cần
tủa. Muối lẫn trong ADN sẽ ảnh hường đến kết quả các thí nghiệm sau này
nên người ta thường tiến hành rửa tủa ADN bằng dung dịch ethanol 70%.
4. Các bước tiến hành
4.1. Nghiền nhỏ mẫu thực vật
- Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuy
ễn, sau đó cho 8 g lá lúa (được làm đông
lạnh trước khi dùng) xay cho đến khi thành bột mịn.

C NaCl 1M và
cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA .
- Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa ADN.
- Quay li tâm, lấy phần tủa.
- Cho 20ml cồn 70 %, quay li tâm, lấy phần tủa.
- Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay li tâm lấy phần tủa.
- Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô ADN. Lúc này
ADN sẽ chuyến sang trong suốt không màu
- Hòa tan ADN thu được vào 2ml đệm TE, bảo quản ở -20
o
C cho thí
nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
5
BÀI 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ ĐỘ TINH SẠCH CỦA ADN BẰNG

HSPL : hệ số pha loãng
OD
260
: chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
OD
280
: chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
1.2 Đo độ tinh sạch của ADN
Trong mẫu ADN thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm
tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của
dung dịch nucleic acid được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai
bước sóng 260nm và 280nm.Được tính bằng công thức sau:

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
6
Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280 (4)
Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch ADN được xem là
tinh sạch. Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất. Đối với dung dịch
ADN sợi đôi, nếu tỉ lệ quá lớn thì chứng tỏ ADN có chứa trong mẫu bị biến tính
hay bị phân hủy.
1.3 Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect)
Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ
ở bước sóng của ADN tăng lên khi ADN
biến tính tức là hai sợi đơn tách rời khỏi nhau. ADN không bền đối với nhiệt.
Khi tăng nhiệt độ của ADN lên quá nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) thì mạch đôi
sẽ tách ra do sự phá vỡ của các liên kết Hidro. Nểu để nhiệt độ giảm từ từ thì hai
sợi đơn lại bắt cặp với nhau nhưng chúng không có khả năng bắt cặp lạ
i khi làm
lạnh đột ngột sau khi biến tính.
2. Dụng cụ và hóa chất


Bảng 1 : Kết quả đo OD260 và OD280 của các mẫu ADN
Bước
sóng
ADN không biến
tính
ADN biến
tính
ADN phục hồi sau biến
tính
260 nm
280 nm Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

1,5% 200 - 3000
2,0% 100 - 2000

Trong điện di ADN thường sử dụng hai loại đệm đó là đệm TBE và đệm
TAE. Đệm TAE dùng để phân tách các phần tử ADN có kích thước lớn còn đệm
TAE thường dùng để phân tách các phần tử ADN có kích thước nhỏ. Nhưng
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
9
λHinIII digest
bp
23130
9416
6557
2322
2027
564
125
trong trường hợp cần làm sạch ADN thì phải dùng đệm TAE vì đệm TBE có
chứa boric acid làm ảnh hưởng đến qúa trình làm sạch sau này.
Sau khi tiến hành điện di thì cần phải làm hiện hình các phân tử ADN trên
gel. Đối với gel Agarose thì người ta dùng thuốc nhuộm ethidium bromide. Chất
này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử ADN và phát huỳnh quang khi
chiếu tia tử ngoại.Đối với gel polyacrylamid các phần tử được đánh dấu bằng
đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng đượ
c phát hiện bằng kĩ thuật phóng xạ tự
ghi.

Máy điện di ngang HOEFER HE33
Máy HOEFER HE 33 là thiết bị điện di trên gel agarose loại nhỏ, có cấu
tạo dạng nằm ngang. Máy HE 33 được chế tạo dựa trên ý tưởng cần tiến hành

Tris base 0,4M 44,8g
Acetic acid 0,2M 11,4g
EDTA 0,01M 20,0ml
Định mức đến 1000ml
+ Đệm tải mẫu
Glycerol 30%
Brommophenol Blue 0,25%
Tris 200mM
Na2EDTA 20mM
+ Thuốc nhuộm ADN: dung dịch ethidiume bromide 10mg/ml

2.3 Dụng cụ
Máy li tâm
Eppendorf 1.5ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Máy điện di ngang HOEFER HE33
Bộ nguồn điện di điện thế từ 80 -150V
Bộ chụp ảnh trên đèn UV
Lò vi sóng
Bình tam giác
3 Các bước tiến hành thí nghiệm
3.1 Chuẩn bị gel
Trong bài thí nghiệm này tiến hành điện di ADN được chiết tách ra từ lá
mía ở bài 1 và điện di trên gel agarose 0.8% với đệm điện di là đệm TAE.
- Pha loãng 10 lần đệm 10×TAE bằng nước cất.
- Cân 0.8g agarose vào bình tam giác loạ
i 300ml, có cho lắc từ vào
- Cho 100ml đệm 1×TAE đã được chuẩn bị ở trên.
- Bao miệng hình tam giác bằng nilông rồi đun nóng trong lò vi sóng 30
giây, lắc cho gel tan hoàn toàn. Nếu chưa tan hoàn toàn thì lại làm tiếp như trên


Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
12
BÀI 4: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CHỦNG E. coli

1. Nguyên tắc
Phương pháp PCR thường được dùng để phát hiện các khuẩn mang mầm
mống bệnh hay các chủng vi sinh vật có trong môi trường. Đem nhân dòng bằng
phương pháp PCR một gen đặc hiệu của một chủng vi sinh vật nào đó, nếu đoạn
gen đó được nhân lên thì chứng tỏ chủng vi sinh vật đó có chứa trong mẫu cần
kiểm tra. Ở đây chúng ta sử
dụng đầu mồi của gen rnhA có trong chủng E. Coli
để kiểm tra sự hiện diện của chủng E.coli trong mẫu cần phân tích .
Một thí nghiệm để phát hiện khuẩn mang mầm mống bệnh gồm các bước
sau:
Tăng sinh: Tăng số lượng vi khuẩn có trong mẫu trước khi đem tiến hành
nhân dòng bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trong dịch nuôi.
Xử lí mẫu: Thu vi sinh vật sau khi nuôi cấy và phá bỏ màng tế bào để thu
ADN
Phản ứng PCR: nhân dòng bằng phươ
ng pháp PCR
Phân tích sản phẩm sau khi nhân dòng bằng phương pháp điện di ADN
1.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là phương pháp khuếch đại tạo dòng trong ống nghiệm nhằm mục

nhiệt độ Tm của mồi.
Cách tính nhiệt độ Tm
Có nhiều cách tính nhưng ở đây người ta thường dùng cách tính đơn giản
sau
Tm= 4(G+C) + 2(A+T) + 35 - 2n
n: tổng số nucleotid
G, C, A, T: tổng lượng các nucleotid G, C, T, A
Cách tính này đúng v
ới các đoạn mồi từ 16 đến 35 nucleotid
1.3 Tag polymerase
Được chiết tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquticus sống ở suối nước
nóng. Enzyme Tag Polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của các
acid nucleotid và có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp từ đầu đến cuối quá
trình.
2. Hóa chất và dụng cụ
2.1 Hỗn hợp Primer
Nồng độ 2.5 pmol/µl
Nhân dòng đoạn ADN dài 967bp có chứa gen rnhA
Trình tự Nucleotid:
5'-CCATGTACGCCAAAGAATTCCGGAT-3'
3'- CTCTCTTTGTTGAATTTTGAAGTGC-5'
2.2 Hóa Chất
Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
14
Tag polymerase 0,025 U/µl (1,25U/50µl)
Tris-HCl (pH 8.8 ) 75mM
( NH4)2SO4 20mM
Tween 20 0,01%
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200µM mỗi loại

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
15
Step5. lặp lại Step2 đến Step4 29 lần
Step6. 72 độ 10min ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn chỉnh)
Step7 4 độ ∞
Pha chế dung dịch phản ứng (Dung dịch phản ứng phải được pha chế trên
đá)
- Hút 45µ l hỗn hợp phản ứng PCR vào trong ống eppendof 0.2ml. Sau đó
cho 4µl dung dịch hỗn hợp primer. Cuối cùng cho 2µl dung dịch mẫu đã
được xử lí ở trên.
- Lắc nhè và quay li tâm cho dung dịch phản ứng chảy hết xuống đáy không
còn bám trên thánh ống ( Spin down)
- Đặt eppendof và máy PCR
- Khởi động chương trình (khoảng từ 1 đến 2 tiếng)
3.3 Điện di sản phẩm sau phản ứng-Điện di trên gel Agarose (0.8%)
- Gel pha trong dung dịch đệm
điện di 0.5×TBE rồi đun nóng bằng lò vi
sóng cho đến khi gel được nóng chảy hoàn toàn.
- Trong khi để cho gel nguội đến 50 độ, tiến hành lắp dụng cụ điện di. Sau
khi gel nguội đổ gel vào khuôn gel có cắm lược và chờ cho gel đông tụ
hoàn toàn.
- Sau khi gel đông tụ rút lược đổ đệm điện di ngập bản gel 1-2mm
- Pha 2µl ADN mẫu + 1µl thuốc nhuộm + 7µl nước cất tuyệt trùng. Dùng
pipetman tra hỗn hợp mẫu và 2
µl maker vào từng giếng gel.
- Chạy điện di với hiệu điện thế 80V trong vòng 30 phút.
- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong vòng 30 phút.
- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.