TCNCYH 23 (3) 2003
ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP trong định nhóm HLA

TS. Bạch Khánh Hoà
Labo trung tâm y sinh học, Đại học Y Hà Nội

Phức hệ chủ yếu hoà hợp mô ở ngời chiếm một vùng khoảng từ 4 đến 5 megabaes (Mb) trên
cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6. Trong lịch sử, kháng nguyên bạch cầu ngời (HLA: Human
leucocyt Antigen) đợc xác định bằng huyết thanh học, sau đó là kỹ thuật tế bào, kỹ thuật tính đa
dạng các mảnh do men hạn chế(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP). Ngày nay, kỹ
thuật đợc sử dụng nhiều và có độ tin cậy cao là oligonucleotid probe. Phân tử HLA rất đa dạng,
các kháng nguyên này gây ra cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào.
Trong bài này chúng tôi trình bày kỹ thuật: Phản ứng chuỗi polymerase với những mồi có trình tự
đặc hiệu (PCR- SSP: Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Primers) để định nhóm HLA
nhằm mục đích sử dụng trong lâm sàng chọn hoà hợp ngời cho và ngời nhận tạng mà chúng tôi
đã thực hiện ở Việt Nam từ 2000.

1. Mở đầu: kháng nguyên miễn dịch bạch
cầu của ngời (human leucocyte antigen-
HLA) nằm một phần quan trọng trong hệ thống
di truyền, đợc gọi là hệ thống chủ yếu hoà hợp
mô (complex major histocompatibilite
CMH), hệ thống này nằm trên cánh ngắn của
nhiễm sắc thể số 6 (đoạn 6p21.3). Lần đầu tiên
hệ thống này đợc phát hiện bởi J.Dausset,
1958, và ông đã đợc nhận giải thởng Nobel
về Y học năm 1980 [1]. HLA có vai trò chủ
đạo trong đáp ứng miễn dịch. Tính đa dạng
trong cấu trúc đã dẫn đến những khó khăn
trong xác định kháng nguyên và hiểu biết về
chức năng của nó ứng dụng trong lâm sàng.

kỹ thuật đang đợc sử dụng nhiều nhất, đó là
những kỹ thuật về sinh học phân tử.
2.2. Sự phát triển ngày càng gia tăng trong
nuôi cấy dòng tế bào thì sự hiểu biết gen của
lớp I (1980) và lớp II (1982) cũng ngày càng
sâu sắc hơn giúp cho giải thích đợc ADN bổ
sung và bộ gen (genomique) cho phép chúng ta
sử dụng sonde thứ hai của HLA.Ngời ta có thể
sử dụng sond này trong phản ứng lai với ADN
của bộ gen để nghiên cứu tính đa dạng của loci
Tiến sĩ, phó trởng Labo Trung tâm Y sinh học trờng Đại học Y Hà Nội.

130
TCNCYH 23 (3) 2003
hay của allen. Kỹ thuật sinh học phân tử đầu
tiên đợc áp dụng trong định nhóm HLA dựa
trên sự phân tích số lợng và kích thớc đoạn
ADN lai với sond đặc hiệu của HLA sau khi
nó bị cắt bởi enzym giới hạn. Kỹ thuật này gọi
tên là " tính đa dạng các mảnh do men hạn chế
(RFLP) [2]. Đây là kỹ thuật định nhóm HLA
đợc sử dụng chủ yếu trong workshop-HLA
1997, và cho thấy có nhiều tiến bộ quan trọng,
nhất là trong xác định và nghiên cứu tính đa
dạng của lớp II, trong ghép cơ quan và tổ chức.
Kỹ thuật RFLP cũng lần đầu tiên cho phép xác
định HLA-DP mà không cần đến kỹ thuật tế
bào và giải thích những hiện tợng không
giống nhau của DP trong nuôi cấy hỗn hợp hai
quần thể tế bào (culture mixte) [3]. Nó cũng

nhiều phòng thí nghiệm hoà hợp mô trên thế
giới ngời ta sử dụng kỹ thuật PCR là kỹ thuật
thờng quy để định nhóm kháng nguyên bạch
cầu, 1999 Phạm Đăng Khoa, Vũ Triệu An và
cộng sự của bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh
trờng Đại học Y Hà Nội đã thực hiện kỹ thuật
này để định nhóm DRB1 [2]. Từ tháng 10-
2000 tại phòng thí nghiệm Y Sinh học của
trờng Đại học Y Hà Nội, chúng tôi cũng đa
vào thực hiện kỹ thuật PCR-SSP để định nhóm
cho HLA- A, B, DR, DQ. Loại kit chúng tôi sử
dụng là Độ phân giải thấp (Low resolution)
của Dynal, nó cho kết quả tơng đơng với kết
quả làm huyết thanh học. Kỹ thuật PCR-SSP
đợc sử dụng để chọn lựa ngời cho và ngời
nhận trong ghép tuỷ, ghép cơ quan, tìm mối
liên quan giữa HLA với một số bệnh Đối với
kít Độ phân giải cao (High resolution) xác
định đợc allele có mặt trên nhiễm sắc thể sẽ
cho kết quả có độ phân tích cao hơn nhng giá
thành đắt. Vì vậy chúng tôi lựa chọn kỹ thuật
PCR-SSP độ phân giải thấp dựa trên những
điểm sau:
- Chất lợng kỹ thuật: không cho hoặc rất ít
hiện tợng dơng tính giả
- Thời gian thực hiện kỹ thuật ngắn
- Giá thành xét nghiệm không cao
- Trang thiết bị trong phòng thí nghiệm của
chúng tôi đảm bảo thực hiện đợc kỹ thuật này
Không gây độc nhiều cho ngời thực hiện

o
C trong 10 giây, 61
o
C trong
50 giây, 72
o
C trong 30 giây
. Điện di trên gen agarose 2% trong đệm
TAE 0.5M, 100vol trong 15phút
. Chụp ảnh và phân tích kết quả bằng phần
mềm của Dynal bán kèm theo kit.
Chúng tôi cũng xin trình bày sơ lợc về quy
định danh pháp quốc tế: do có sự tiến bộ trong
kỹ thuật định nhóm HLA nên các quy định về
danh pháp cũng thờng xuyên đợc thông qua
ở các hội nghị quốc tế về HLA, nó cho phép
phân biệt kỹ thuật sử dụng trong định nhóm
HLA là huyết thanh học hay sinh học phân tử
[4]. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử ngời ta
quy định cách viết nh sau:
HLA + locus + * + alen (2 hoặc 4 con
số).
HLA đợc xác định giữa ngời cho và ngời
nhận để quyết định có ghép thận cho bệnh nhân
hay không?
Tóm lại: do chức năng trình diện đặc hiệu
kháng nguyên peptid, do tính đa dạng của các
phân tử đợc biểu lộ, vai trò phân định danh

132
TCNCYH 23 (3) 2003
mục của lymphô T nên hệ thống HLA đóng
một vai trò chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch.
Điều này giải thích những đóng góp của hệ
thống này trong ghép , trong mối liên quan của
nó với một số bệnh, trong cảnh giác với phát
triển u, trong truyền máu và trong nghiên cứu
quần thể hay trong pháp y.
Nếu việc mô tả tính đa dạng của phân tử và
gen học đã cho những thành công liên tục trong
ghép (đặc biệt trong ghép tuỷ xơng). Những
nghiên cứu về trình tự kháng nguyên và gen
còn giải thích đợc ngày càng rõ hơn sự liên
quan trong tính nhạy cảm hay đề kháng của
một số bệnh (đặc biệt là bệnh tự miễn). Điều
này đã giúp các thầy thuốc lâm sàng trong
miễn dịch trị liệu nhằm khôi phục lại những
hoạt động bình thờng của hệ thống miễn dịch.
Tài liệu tham khảo
1. Vũ Triệu An, J.C.Homberg : Miễn dịch
học. 1997, 105: 120-123.
2. S.A.Miller, D.D.Dykes and H.F. Polesky:

copy). HLA molecules contain multiple alloepitopes that are capable of inducing humoral and
cellular responses during alloimmunization.
This paper, we present the clinical HLA testing: HLA typing (PCR-SSP) to identify HLA
specificities to determine compatibility between a specific donnor- recipient pair.

133