SEMINAR CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG
DỤNG
TP.Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2014
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
I. TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE:
1. Lịch sử phát triển
- Năm 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác
dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 400
0
C-600
0
C.
- Năm 1833: Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có
khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp,
diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này theo đề nghị của Duclo, Enzyme
phân giải tinh bột được gọi là Amylase.
- Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành
đường. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động
vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm nghiên cứu.
- Năm 1862, Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp
thụ chọn lọc.
- Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là 19000.
- Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của β-Amylase là 250000.
- Đến năm 1952, người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4
Enzyme α-Amylase.
- Năm 1971: Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đã
xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase và glucoAmylase trong canh trường
nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt tính dextrinase và transglucosilase.
2. Amylase là gì?
- Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh. Nhóm
Enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin
6-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-
glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10). Các Enzyme này thủy
phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
- Exoamylase: Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi
polysaccharide. Nhóm này gồm có:
+ β-Amylase (EC 3.2.1.2)
+ Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3)
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 3
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Hình 1. Các loại Enzyme endoAmylase và exoAmylase
3.1. Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1):
a. Cấu tạo:
Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng
50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn
Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất
rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-
Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình
thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi
mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các
Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau.
Hình 2.Cấu trúc không gian của α-Amylase
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 4
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
b. Cơ chế tác dụng của α-Amylase:
α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-Amylase có
khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất
( tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả.
α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột
Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấm sợi
chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Nồng độ α-Amylase của VSV tương đối lớn
có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-Amylase của
nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%.
Điều kiện hoạt động của α-Amylase từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-Amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 ( có thể
hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8 ).
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-Amylase từ các nguồn khác nhau
cũng không đồng nhất, α-Amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt.
Nhiệt độ tối thích của nó là 50
0
C và bị vô hoạt ở 70
0
C (Kozmina, 1991 ).
3.2. Enzyme β-Amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2):
a. Cấu tạo:
β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. Ở trong các
hạt ngũ cốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong
tinh bột , glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử
của mạch . Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-Amylase có cấu hình β.
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 6
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình
nảy mầm của hạt. Ở lúa, β-Amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu
như không được tổng hợp ở hạt khô. Ở lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó
được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này
là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease
sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và có khối lượng phân tử là 59.000 Da .
b. Cơ chế tác dụng của β-Amylase:
β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt đầu
b. Cơ chế hoạt động:
Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều
lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được các
liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ). Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào
bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng như kích
thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân . Nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose và
amylopectin ) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit.
c. Tính chất:
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi thuỷ
phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân
tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose.Ngoài các liên kết α-1,4 và α-
1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside .
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen , amylopectin ,
dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuả các
loại Enzyme khác. Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so
với các chất có phân tử nhỏ. Các polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-
dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh.
Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 50
0
C . Nó
bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ
bởi Ca
2+
.
3.4. Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10)
Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose , panose và
các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở VSV nhưng đồng thời
cũng có trong các hạt nảy mầm ( đại mạch, thóc nảy mầm ). Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệ
dextrinase của hạt ngũ cốc , hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–glucosidase hay R–
Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay dextrin-6-
không phân nhánh.
• Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được cấu tạo từ
600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-
glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi
hỗn hợp gồm nước và tinh bột bị đun nóng (60-850C) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được
gọi là hồ tinh bột .
Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị
phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 9
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp
tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose. Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn
cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp
tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose.
Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là
đường và tinh bột.
Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và
được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa
glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật. Glucogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau
bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-
glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột, phân tử lượng ở trong khoảng 2 - 3 triệu
Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể
chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung
chủ yếu ở trong gan.
II. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE
1. Đơn vị đo hoạt tính
Mục đích xác định hoạt tính Enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Có một số
cách định nghĩa như sau:
1.1. Đơn vị Enzyme quốc tế (UI) do hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) định nghĩa
Một đơn vị Enzyme là lượng Enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được 1
nhất định ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
- Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản
phẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
- Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự biến
thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
* Có nhiều phương pháp xác định hoạt tính Enzyme. Nhưng khi so sánh chất lượng giữa
các chế phẩm với nhau thì phải dùng 1 phương pháp thống nhất.
3.1. Xác định hoạt tính Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme α-Amylase có trong dịch
chế phẩm nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo
thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quang
điện sẽ tính được hoạt tính Enzyme.
Đơn vị hoạt tính Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1g tinh bột tan thành các
dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 30
0
C trong thời gian 1 giờ.
3.2. Xác định hoạt tính Enzyme γ-Amylase (glucoAmylase)
Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 11
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong chế
phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt tính Enzyme.
Đơn vị hoạt tính glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan
pH= 4.7 ở nhiệt độ 30
0
C trong 1 giờ giải phóng được 1 mg glucose.
3.3. Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoAmylase có trong
dịch chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệu
của Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt tính Enzyme.
32
O
C, độ ẩm 57% và nuôi
trong 42 giờ.
Ngoài tinh bột, môi trường cần chứa maltose và dextrin. Sự có mặt của glucose,
fructose và saccarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sự
tích tụ Amylase. Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào môi trường lỏng thì nấm mốc phát
triển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase.
Ngoài gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đều
cần đến chất chứa nitơ. Tốt nhất là nguồn đạm vô cơ vì:
+ Nguồn nitơ có thể có sẵn trong cám, bột ngô, khi cần thiết có thể bổ sung thêm từ
khô lạc, khô đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure. Khi đó lượng Enzyme được tổng hợp
nhiều hơn.
Ví dụ: Theo kết quả nghiên cứu của giáo sư Phenicxôva, nấm mốc Asp.awamori có thể
phát triển tốt trong môi trường chứa 0,05% đạm vô cơ nhưng để tạo α-Amylose thì cần tăng
nồng độ tới 0,15%, để tạo glucoamylase cần tăng tới 0,4%.
+ Nguồn đạm hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc
nhưng ít có hiệu quả về phương diện tích tụ Enzyme.
Ví dụ: Khi bổ sung gelatin casein và ngay cả cao ngô vào canh trường thì việc tích tụ
Enzyme vẫn thua kém so với nguồn đạm vô cơ. Ngược lại, nếu ta thêm mầm, rễ của hạt ươm
mầm vào canh trường lại có tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme.
Sự tạo thành và tích tụ Amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg
2+
, Ca
2+
và
photpho, đặc biệt là magie. Trong môi trường thiếu Mg
2+
, Amylase hầu như không được tạo
thành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05%. Sau Mg
Asp.awamori 14.5 850.0 30.0 0
3. Điều kiện nuôi cấy
Chủng giống và môi trường nuôi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đó ta còn phải chú
ý đến những điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển và tích tụ Enzyme. Bao gồm:
3.1. Nhiệt độ
Duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường bằng cách quạt không khí lạnh và ẩm vào canh
trường. Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng thì cần làm lạnh đồng thời kết hợp với sục khí.
Nhiệt độ không khí trước khi đưa vào phòng nuôi phải vào khoảng 22-25
0
C, còn độ ẩm
tương đối của không khí là 98-100%.
3.2. Độ ẩm canh trường
Trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu để nấm mốc phát triển nằm
trong giới hạn 65-70%.
Trong thực tế sản xuất, mức độ vô trùng không thể đạt được như trong phòng thí
nghiệm vì vậy nên thường nuôi cấy trong canh trường có độ ẩm thấp hơn, nhằm hạn chế sự
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 14
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
phát triển của tạp khuẩn.Tùy theo điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi mà độ ẩm có thể khống
chế ở 50- 60%.
Độ ẩm canh trường thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn, nhưng nấm mốc
cũng phát triển chậm dẫn đến tích tụ Enzyme ít và phải kéo dài thời gian. Do đó phải thực
hiện tốt công việc vệ sinh.
3.3. pH môi trường
pH ít ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, thường pH tự nhiên của
môi trường vào khoảng 5,5-6,0. Nhưng lại có ảnh hưởng nhiều tới tích tụ Enzyme, nên cần
sử dụng acid hoặc amoniac để điều chỉnh, giữ cho pH luôn trong giới hạn tối ưu.
pH thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh hưởng tới tích tụ
Enzyme.
3.4. Cung cấp oxy
C.
- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài có khả năng tổng hợp Amylase mạnh mẽ, tuy
nhiên, cũng có một số, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt.
Trong công nghiệp, các biến chủng được tạo bằng cách gây đột biến là những chủng hoạt
tínhng rất có khả năng sinh tổng hợp nhiều Amylase. Đáng chú ý là những biến chủng của
nấm mốc : Asp.niger S, Asp.niger S-4, Asp.niger S-4-10, Asp.usamii 3758-45, Asp.batatae
217-61, Asp.awamori 78-2, …
Hình 4. Quy trình công nghệ chung
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 16
Chuẩn bị môi trường
Phá vỡ tế bào
N
u
Enzyme ngoại bào
Enzyme nội bào
Lọc hoặc ly
tâm
Enzyme thô
Cô đặc
Enzyme tinh
khiết
Sấy
Tinh chế
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
2. Giải thích quy trình
2.1. Nuôi cấy vi sinh vật giống
- Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân
lập và chọn giống vi sinh vật để tuyển lấy những chủng hoạt tínhng mạnh, đồng thời phải tiến
hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá
các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính
cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất
của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần bổ sung thêm các chất khác nữa.
• Cám mì có 16-22% tinh bột, 10-12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như
methionine (0.19%), cystine (0.3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0.3%), 3- 4%
chất béo, 10.3% celulose, các nguyên tố trơ (Na-0.09% , K-1% , Ca-0.16% , P-0.94% ) và các
nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột, 10-15% chất béo,
10-14% protein, 8-16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37-5 9 %).
• Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính của Enzyme. Cám không
được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng,
không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0.05%.
Độ ẩm tối thích cuả môi trường
• Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58-60% và phải giữ cho
môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55-70% sẽ làm giảm
độ thoáng khí, còn thấp hơn 50-55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
cũng như sự tạo Enzyme Amylase.
Bảng 2: Ảnh hưởng của việc giữ độ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-
Amylase của Asp.Ozyrae nuôi bằng phương pháp bề mặt
Phương án thí
Nghiệm
20 giờ 34 giờ 42 giờ
Độ
ẩm
%
Hoạt tính của
Amylase dv/g
Canh trường khô
Độ
ẩm
%
Hoạt tính của
0
C , đôi khi cao hơn tới 47
0
C. Vì vậy cần phải hạ nhiệt
độ phòng nuôi giúp cho sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng
có nhiệt độ 28-29
0
C và độ ẩm cao vào phòng nuôi.
• Thời kỳ tạo Enzyme Amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10-20 giờ). Trong thời kỳ này các quá
trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự toả nhiệt giảm mạnh. Các Enzyme Amylase được tổng
hợp mạnh mẽ. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3-4
0
C so với
giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là
28-30
0
C , cho Bac.subtilis là 35– 37
0
C.
• Thời gian nuôi để có được lượng Amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm.
Sự tạo bào tử là một hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt tính của
Enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo Amylase cực đại thường kết thúc khi
nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi
để có thể tích lũy lượng Amylase cực đại đối với từng loại nấm mốc và vi khuẩn như sau:
b. Nuôi vi sinh vật tạo Amylase bằng phương pháp bề sâu
Môi trường dinh dưỡng
• Đặc điểm chung cho mọi môi trường nuôi vi sinh vật tạo Enzyme Amylase là có chất cảm
ứng: tinh bột, dextrin hay maltose. Nguồn nitơ dinh dưỡng thường dùng là nitơ vô
cơ (NaNO
3
β-Amylase 3,5-7,0 50
GlucoAmylase 4,5-4,7 55-75
Asp.Niger
α-Amylase 4,7- 6,0 65
GlucoAmylase 3,8 50
Asp.Asami
α-Amylase 3,8 50
GlucoAmylase 5,0 55
Asp.Oryzae
α-Amylase 5,5-5,9 50-57
β-Amylase 4,8 30
GlucoAmylase 4,8 50
Bac.amyloliquefacien
s
α-Amylase 5,7-6,0 55-60
Bac.diastaticus α-Amylase 5,8 70
Bac.subtilis α-Amylase 4,6-5,1 37
Endomyces sp GlucoAmylase 4,8 55
Phizopase doleamar GlucoAmylase 5,5 45
2.2. Thu dịch Enzyme
a. Đối với Enzyme nội bào nuôi bằng phương pháp bề mặt
• Giải phóng Enzyme bằng cách phá vỡ tế bào bằng nhiều cách như:
Nghiền nhỏ với cát, thủy tinh.
Để tế bào tự phân hủy.
Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng dung dịch muối
trung tính, dung môi hữu cơ.
Kết tủa Enzyme bằng các chất điện ly thích hợp.
b. Đối với Enzyme ngoại bào nuôi theo phương pháp chìm
• Tách sinh khối và bã bằng cách lọc li tâm, lọc ép có sử dụng tác nhân trợ lọc (diatomit, đất
hoạt tính) hoặc các tác nhân trợ kết tủa (CaCl
izopropanol, aceton) hoặc muối trung tính phổ biến nhất là (NH
4
)
2
SO
4
. Sau khi li
tâm tách kết tủa có thể trộn thêm các chất ổn định rồi sấy khô và nghiền mịn để thu
được chế phẩm dạng bột.
Hình 5. Máy cô đặc chân không
2.4. Thu chế phẩm Enzyme tinh khiết
a. Tinh chế Enzyme :
- Hòa tan Enzyme thô dạng bột vào nước hoặc dung dịch muối CaCl
2
ở nồng độ
thích hợp hoặc dung dịch đệm, kết tủa trở lại bằng ethanol, aceton hay (NH
4
)
2
SO
4
.
Quá trình này cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp để tránh sự vô hoạt
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 21
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Enzyme. Sau khi kết tủa các muối vô cơ được loại đi bằng phương pháp thẩm tích,
thẩm thấu ngược hoặc lọc gel.
- Tách Enzyme bằng phương pháp hấp phụ chọn lọc: cho dịch Enzyme chảy từ từ
qua cột chất hấp phụ (thường là oxit nhôm, silicagel) các Enzyme khác nhau sẽ
được hấp phụ với khả năng khác nhau, sau đó dùng các dung dịch đệm thích hợp
điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.
Chọn giống nấm mốc Aspergillus oryzae có các ưu điểm sau:
- Không sinh tổng hợp độc tố.
- Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính cao.
- Khả năng thích nghi nhanh và tốc độ sinh trưởng mạnh.
- Điều kiện nuôi cấy: đơn giản.
- Môi trường nuôi cấy: rẻ tiền, dễ tìm.
- Dễ dàng tách được khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu nhận enzyme ngoại bào.
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 23
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
2. Quy trình len men và thu nhận Amylase theo phương pháp lên men bề mặt:
2.1. Quy mô phòng thí nghiệm:
Hình 6. Quy trình thu nhận amylase trong phòng thí nghiệm
2.2. Quy mô công nghiệp :
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 24
Nguyên liệu
Xử lý nguyên liệu
GiốngVi sinh vật
Hấp thanh trùng
Nhân giống
Làm nguội
Trộn giống VSV
Giống cho sản xuất
Nuôi cấy
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Hình 7. Quy trình sản xuất Amylase trên quy mô công nghiệp
2.3. Nhân giống vi sinh vật
Giống sản xuất thường được bảo quản để tránh giảm hoạt tính. Do đó, việc cấy giống
trên môi trường thạch nghiêng trước khi nhân giống là việc làm rất cần thiết. Có thể coi đây là
việc “đánh thức” chủng giống, đồng thời để kiểm tra hoạt tính của giống sau một thời gian
Copyright: Tài liệu đại học ©