Bộ giáo dục Và đào tạo viện khoa học
và công nghệ việt nam
Viện công nghệ sinh học

Đỗ Thị Ngọc Huyền
Nghiên cứu tính chất
phytaza tự nhiên v tái tổ hợp
của vi khuẩn Bacillus subtilis

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số : 62 42 40 01
Tóm tắt Luận án tiến sĩ sinh học
Luận án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc họp tại
Viện Công nghệ sinh học
vào hồi 9 giờ ngày 31 tháng 8 năm 2007

Có thể tìm hiểu luận án tại th viện: Viện Công nghệ sinh học, Th viện Quốc gia
Hà Nội 1
Mở đầu

1 Tính cấp thiết của đề tài
Photpho là nguyên tố đa lợng cần thiết cho sự phát triển của ngời
và vật nuôi. Nhng đa số thức ăn cho gia súc có nguồn gốc từ các hạt thực
vật đặc biệt là ngũ cốc đều có chứa sẵn photpho. Tuy nhiên, photpho trong
các nguyên liệu này có tới 80% nằm dới dạng phân tử phytat hoặc axit
phytic (myo-inositol hexan photphat) rất khó tiêu hóa đối với các loài
động vật dạ dày đơn nh gia cầm, lợn, cáDo đó, cần phải bổ sung
những hợp chất chứa photpho vô cơ vào thức ăn để đáp ứng đủ nhu cầu

3 Nội dung nghiên cứu
9 Phân lập và tuyển chọn các chủng B. subtilis sinh phytaza cao từ một
số nguồn đất và phân động vật nhằm thu đợc phytaza có tính chịu
nhiệt.
9 Nghiên cứu thu nhận và xác định tính chất phytaza tự nhiên từ chủng
B. subtilis.
9 Phân lập gen phyC mã hóa cho phytaza từ B. subtilis làm tiền đề cho
việc biểu hiện chúng trong các hệ biểu hiện khác nhau.
9 Thiết kế và biểu hiện gen phyC trong vi khuẩn E. coli để thu nhận và
xác định tính chất của PhyC tái tổ hợp.
4 Những đóng góp mới của luận án
Bản luận án này có những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn nh
sau:
9 Xác định đợc các đặc điểm sinh học và đã phân loại đến loài chủng
vi khuẩn phân lập từ đất và phân động vật ở Việt Nam có khả năng
sinh phytaza cao.
9 Đã tạo dòng và xác định trình tự gen phyC mã hóa phytaza của vi
khuẩn B. subtilis. Đây là gen mã hóa phytaza đầu tiên đợc phân lập
và xác định trình tự từ vi khuẩn B. subtilis đợc phân lập ở Việt Nam.
Trình tự của gen này đã đợc đăng ký trong Ngân hàng trình tự gen
Quốc tế.
9 Lần đầu tiên trong điều kiện Việt Nam đã biểu hiện thành công gen
phyC mã hóa phytaza từ B. subtilis trong vi khuẩn Escherichia coli.
9 Đã làm sáng tỏ đợc một số tính chất của phytaza tự nhiên từ chủng
B. subtilis và PhyC tái tổ hợp, từ đó giúp cho các cơ sở sản xuất ứng
dụng phytaza của B. subtilis một cách đúng đắn trong chăn nuôi. 3


các axit béo không no làm giảm khả năng tiêu hóa thức ăn của động vật
và giảm giá trị dinh dỡng của nguồn thức ăn (Lei et al., 1993). Ngoài
ra, axit phytic còn tác động đến một số enzym nh tripsin, pepsin, -
amylaza, -galactosidaza và kết quả là làm giảm hoạt tính của các enzym
tiêu hóa quan trọng này (Inagawa et al., 1987).
1.2 Những nghiên cứu về phytaza
Phytaza là một enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic
thành các myo - inositol photphat phân tử thấp và các monophotphat vô

4
cơ. Khi phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn bộ các gốc
photphat trong phân tử axit phytic và tạo thành các myo - inositol tự do.
Phytaza có tên gọi đầy đủ, theo quy ớc quốc tế là: myo - inositol
hexan photphat photphohydrolaza. Mullaney và Ullah (2003) đã chia
phytaza thành 3 nhóm dựa trên cơ sở cấu trúc và các đặc tính xúc tác
khác nhau của nó, bao gồm các nhóm photphataza axit histidin (HAP),
photphataza axit tía (PAP), phytaza -propeller (BPP). Phytaza thuộc
nhóm HAP thờng có mặt ở nấm mốc, E. coli, ở một số loài thực vật và
chuột. Chúng cùng có một trình tự hoạt động bảo thủ là RHGXRXP,
đồng nhất đối với các enzym thuộc nhóm này. Phytaza thuộc nhóm PAP
đợc biết là metalophotphoesteraza, có mặt chủ yếu ở rễ thực vật để
giúp cho thực vật lấy đợc nguồn photpho trong đất, đáp ứng lại một
cách bình thờng đối với tình trạng thiếu photpho. Phytaza thuộc nhóm
BPP chỉ có ở vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Chúng có tính đặc hiệu cơ chất
nhất, bền nhiệt và chỉ hoạt động ở pH trung tính (Kerovuo et al., 2000,
Oh et al., 2001,Tye et al., 2002).
Chơng 2 - vật liệu v phơng pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu nghiên cứu
226 mẫu đất và phân động vật lấy từ các cánh đồng trồng ngô, lúa
và khu chăn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc. Chủng E. coli DH5, chủng

phân của chúng thải ra ngoài môi trờng làm chất cảm ứng cho sinh tổng
hợp phytaza. Nhng cũng chính nồng độ axit phytic quá cao trong phân
gia cầm cùng một số chất ức chế khác có thể là nguyên nhân khiến cho
số lợng vi khuẩn sinh phytaza phân lập từ nguồn này là thấp nhất. Theo
một số tác giả đã công bố, hầu hết các chủng vi khuẩn có khả năng sinh
phytaza ngoại bào mạnh đều đợc phân lập từ các mẫu đất trồng lúa, từ
các sản phẩm đậu tơng lên men truyền thống và đất gần khu chăn nuôi
[Kim et al., 1998, Powar và Jagannathan (1982), Shimizu (1992)].
Các
kết quả nghiên cứu của chúng tôi khi phân lập đợc các chủng chủ yếu ở
đất gần khu chăn nuôi gia cầm là hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu
nêu trên.
3.1.2 Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh
phytaza cao
Để có thể dễ dàng tuyển chọn đợc chủng vi khuẩn sinh phytaza
cao, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc định tính dựa vào vòng phân giải
canxi phytat trên thạch đĩa. Kết quả chúng tôi đã thu đợc 4 chủng với

6
đờng kính vòng thủy phân nhỏ hơn 0,5 cm, 7 chủng có đờng kính
vòng thủy phân lớn hơn 0,5 cm và 1 chủng có đờng kính vòng thủy
phân lớn hơn 1 cm. Hoạt độ phytaza của các chủng vi khuẩn đợc xác
định theo phơng pháp của Shimizu (1992). Kết quả 2 chủng B1 và B178
cho hoạt độ phytaza cao hơn các chủng khác. Hoạt độ phytaza do chủng
B1 sinh ra là 0,135 U/ml và chủng B178 đạt 0,115 U/ml. Trong đó chủng
B1 đợc phân lập từ đất trồng lúa và chủng B178 thu đợc từ đất gần khu
chăn nuôi gia cầm.
3.1.3 Đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn sinh phytaza
Sau khi quan sát hình thái khuẩn lạc và các phản ứng sinh lý, sinh
hóa của 7 chủng vi khuẩn phân lập dựa theo khóa phân loại của Bergey

cạnh các thành phần dinh dỡng ảnh hởng đến khả năng sinh tổng hợp
của phytaza thì tỷ lệ giống và chất lợng giống cũng là một yếu tố quan
trọng cho sản xuất enzym này. Lợng giống thích hợp để thu nhận
phytaza là 7,5%.
3.2.2 Tối u hóa quá trình sinh tổng hợp phytaza
Mục đích của quá trình này là tìm đợc các yếu tố ảnh hởng nhiều
nhất đến sinh tổng hợp phytaza mà tại đó quá trình sinh tổng hợp đạt cao
nhất.
Kết quả tối u hóa môi trờng sinh tổng hợp phytaza từ chủng B.
subtilis B1 cho thấy hoạt độ phytaza đạt cao nhất là 0,147 U/ml khi nuôi
cấy trên môi trờng có chứa cám gạo với lợng 90 g/l và nồng độ cazein
là 11 g/l. Nhng khi so sánh với hoạt độ phytaza tạo ra trong môi trờng
có chứa cám gạo với lợng 80 g/l, nồng độ cazein là 9 g/l (0,135 U/ml) đã
cho thấy mặc dù sử dụng nhiều cazein hơn khoảng 22% mà hoạt độ
phytaza tăng lên không đáng kể, chỉ khoảng 8,8%. Do vậy, chúng tôi chọn
môi trờng tối u cho sinh tổng hợp phytaza từ chủng B. subtilis B1 có
thành phần nh sau (g/l): Cám gạo 80; cazein 9; CaCl
2,
2; KH
2
PO
4
0,5;
K
2
HPO
4
0,4; NH
4
NO

xem băng nào có hoạt tính. Việc xuất hiện vòng trong mờ trên nền thạch
có bổ sung cơ chất chứng tỏ rằng băng tơng ứng là phytaza. Kết quả ở đờng chạy 3 trên hình 3.7 cho thấy xuất hiện một băng
duy nhất có hoạt tính phytaza với khối lợng khoảng 43 kDa. Khối lợng
này tơng đơng với khối lợng của phytaza đợc tách ra từ chủng B.
subtilis VTTE-68013 (Kerovuo et al., 1998). Trong khi đó phytaza ngoại
bào từ chủng B. subtilis (natto) N-77 đợc thông báo có khối lợng là 36
kDa, Shimizu (1992). Khối lợng của phytaza ngoại bào của chủng
Bacillus sp. DS11 là 45 kDa (Kim et al
., 1998).
Hình 3.7. SDS - PAGE và NATIVE - PAGE
phytaza từ chủng B. subtilis B1
SDS - PAGE Đờng chạy 1. Protein chuẩn;
2. Dịch phytaza thô;
NATIVE - PAGE 3. Băng hoạt tính của phytaza 1 2 3
kDa

h
Tổng th
ể
tích (ml)
Hoạt độ
tổng (U)
Protein
tổng
số (mg)
Hoạt độ
riêng
(U.mg)
Mức độ
tinh sạc
h
(lần)
Hiệu
suất
thu hồi
(%)
Dịch thô 200 24,2 60,32 0,40 1 100
Sau tủa
bằng cồ
n
20 19,5 22,43 0,86 2,15 80

3.3 Nghiên cứu các đặc tính lý hóa của phytaza thô
Việc sử dụng phytaza trong chăn nuôi cần đòi hỏi enzym này có
một số tính chất nh: phải chịu đợc nhiệt độ cao và chịu đợc pH trong
quá trình tiêu hóa thức ăn của động vật. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến

40
60
80
100
120
3456789
pH
Ho
ạ
t đ
ộ

p
h
y
taza t ơn
g
đối
(
%
)
Không có CaCl2
CaCl2 1 mM
b)
0
20
40
60
80
100

trị cao nhất ở 50C. Hoạt độ enzym bắt đầu giảm dần trong khoảng nhiệt
độ từ 55 đến 70
o
C.

11
Nhìn chung tính bền nhiệt của phytaza thô từ chủng B. subtilis B1
phụ thuộc rất lớn vào nồng độ ion canxi có mặt trong dịch enzym. Khi
không có mặt ion Ca
2+
nhiệt độ tối u cho enzym này hoạt động là 40
o
C.
Ngợc lại, khi bổ sung CaCl
2
1 mM vào dịch đệm natri axetat nhiệt độ
tối u của phytaza này tăng lên 50
o
C. Hoạt độ của enzym vẫn còn
khoảng 83,6% sau khi ủ ở 60
o
C trong 20 phút. Điều nay cũng phù hợp
với công bố của tác giả Kim et al., 1998, ông cho rằng khi có mặt
CaCl
2
với nồng độ 5 mM thì phytaza của Bacillus sp DS11 vẫn còn
khoảng 50% sau khi ủ ở 90
o
C trong 10 phút.


taz a c ò n l
ạ
i
(
%
)
30
40
50
60
70
80
b)

Hình 3.9. ảnh hởng của nhiệt độ đến hoạt độ của phytaza
a) ảnh hởng của nhiệt độ đến hoạt độ của phytaza
b) ảnh hởng của nhiệt độ đến độ bền của phytaza
3.4.3 ảnh hởng của pepsin và tripsin đến độ bền của phytaza thô
Phytaza từ chủng B. subtilis B1 không bị tác động bởi tripsin, bởi vì
dù có mặt tripsin ở nồng độ 0,1% và cao hơn là 1% (w/w) thì hàm lợng
photpho vô cơ đợc giải phóng ra vẫn nh nhau.
Còn ngợc lại phytaza bị bất hoạt bởi pepsin có thể là do phytaza
đã bị biến tính ở pH thấp dẫn đến nhạy cảm với pepsin vì khi ở pH thấp
phytaza cũng đã bị ảnh hởng rất lớn. Kết quả này phù hợp với kết luận
Kerovuo et al ., 1998 khi cho rằng phytaza của Bacillus bền với papain,
pancreatin và tripsin, nhng lại bị bất hoạt bởi pepsin ở pH thấp . 12
3.5 Phân lập gen phyC mã hóa phytaza từ vi khuẩn B. subtilis B1
1 2 3 4 5 6 7 1 2

kb

5,14
1,37
0,55

kb
10
6
1
0,5
0,25
1,2
Hình 3.12. Sản phẩm PCR trên gel
agaroza 0,8%
Đờng chạy 1. Chỉ thị phân tử 1 kb;
2. Sản phẩm PCR

A V S S Q A K H K L S D P Y H F T V N A
gcggcggaaacggagccggttgatacagccggtgatgcagctgatgatcctgcgatttgg
A A E T E P V D T A G D A A D D P A I W
ctggaccccaagaatcctcagaacagcaaattgatcacaaccaataaaaaatcaggctta
L D P K N P Q N S K L I T T N K K S G L
gccgtgtacagcctagagggaaagatgcttcattcctatcataccgggaagctgaacaat
A V Y S L E G K M L H S Y H T G K L N N
gttgatatccgttatgattttccgttgaacggaaaaaaagtcgatattgcggcggcatcc
V D I R Y D F P L N G K K V D I A A A S
aatcggtctgaaggaaagaataccattgagatttacgccattgacgggaaaaacggcaca
N R S E G K N T I E I Y A I D G K N G T
ttacaaagcattacggatccaaaccgcccgattgcatcagcaattgatgaagtatacggt
L Q S I T D P N R P I A S A I D E V Y G
ttcagcttgtaccgcagtcaaaaaacaggaaaatattacgcgatggtgacagggaaagaa
F S L Y R S Q K T G K Y Y A M V T G K E
ggcgaatttgaacaatacgaattaaatgcggataaaaatggatacatatccggcaaaaag
G E F E Q Y E L N A D K N G Y I S G K K
gtaagggcgtttaaaatgaattctcanacagaagggatggcagcaaacgatgaatacggc
V R A F K M N S X T E G M A A N D E Y G
agtctttttatcgcaaaagaagatgaggccatctggaagttcagcgctgagccggacggc
S L F I A K E D E A I W K F S A E P D G
ggcagtaacggaacggttatcgatcgtgccgatggcaggcatttaacccctgatattgaa
G S N G T V I D R A D G R H L T P D I E
ggactgacgatttactacgctgctgacgggaaaggttatctgcttgcctcaagccagggt
G L T I Y Y A A D G K G Y L L A S S Q G
aacagcagctacgcgatttatgaaagacagggacagaacaaatatgttgcggactttcag
N S S Y A I Y E R Q G Q N K Y V A D F Q
ataacagacgggcctgaaacagacggcacaagcgatacagacggaattgacgttctgggt
I T D G P E T D G T S D T D G I D V L G
ttcgggctggggcctgagtatccgttcggcctttttgtcgcacaggacggagagaatata

phyL mã hóa cho phytaza của vi khuẩn thuộc chi Bacillus trên ngân hàng
gen Quốc tế. Kết quả cho thấy nó có độ tơng đồng cao nhất đối với gen
phyC của chủng Bacillus sp. DS11, đạt 98% và thấp nhất so với trình tự
nucleotit của gen phyC từ chủng B. subtilis VTTE-68013, đạt 91%. Khi
đối chiếu trình tự axit amin suy diễn của gen phyC từ chủng B. subtilis
B1 với trình tự axit amin suy diễn từ gen phyC của chủng Bacillus sp
DS11 cũng cho thấy mức độ tơng đồng rất cao đạt 98%. Điều đó chứng
tỏ những đột biến trên trình tự nucleotit của gen là những đột biến vô
nghĩa, do đó không gây ra thay đổi đối với sản phẩm của gen ở mức độ
axit amin.
Kết quả phân tích về tơng quan phát sinh chủng loại cho thấy gen
phyC của chủng B. subtilis B1 thuộc nhóm gen mã hóa phytaza từ các
chủng Bacillus sp. DS11 và B. amyloliquefaciens FZB45. Mối quan hệ
giữa các trình tự axit amin của phytaza từ chủng B. subtilis B1 và một số
phytaza từ các chủng B. subtilis khác cũng cho thấy PhyC của chủng B1
có độ tơng đồng cao đạt 98% so với PhyC của chủng Bacillus sp. DS11
và khác xa so với PhyC của chủng B. subtilis VTTE-68013 độ tơng
đồng chỉ đạt 92%.
3.6 Biểu hiện gen phyC trong vi khuẩn E. coli
Với mục đích nghiên cứu tính chất và tạo ra một lợng lớn phytaza
để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, chúng tôi đã đa gen phyC phân lập từ
vi khuẩn B. subtilis B1vào biểu hiện trong E. coli bằng vectơ pET 22b
(+). Lý do chọn vectơ này vì nó có trình tự tín hiệu tiết ra ngoài khoang
chu chất và đợc thiết kế sẵn đuôi polyhistidin giúp cho quá trình tinh
sạch protein tái tổ hợp qua cột sắc ký ái lực đợc dễ dàng.

15
Chúng tôi đã gắn đoạn gen phyC vào vectơ đã mở vòng rồi chọn
vectơ tái tổ hợp. Vectơ này đợc đặt tên là pETphyC đợc biến nạp vào
tế bào E. coli chủng BL21 (DE3) và biểu hiện protein trong môi trờng

116
66
45
35
25

18,4

14,4 1 2 3
Hình 3.20. Kiểm tra tính tan của PhyC tái tổ
hợp trên gel polyacrylamit
Đờng chạy 1. Protein chuẩn; 2. Phytaza dạng tan;
3. Phytaza không tan
PhyC
kDa

116

66

45

35
25

thu đợc sau 4 giờ nuôi cấy không cao, điều này có thể là do nhiệt độ
trên không thích hợp với sự sinh trởng và phát triển của E. coli cho nên
lợng protein tái tổ hợp đợc sản xuất ra thấp. Trong khi đó ở dải nhiệt
độ biểu hiện từ 28 - 37
o
C, lợng protein đợc sinh tổng hợp với hàm
lợng cao hơn hẳn so với ở 22
o
C. Nhng theo tác giả Goedel (1991)
nhiệt độ tối u cho sinh trởng của E. coli là 37
o
C lại không phải là điều
kiện tối u tạo sản phẩm. Ngoài ra, 37
o
C là nhiệt độ thích hợp đối với sự
hoạt động của rất nhiều enzym, đặc biệt là proteaza, enzym này có khả
năng phân cắt protein tái tổ hợp. Trong một số bài báo đề cập đến các
điều kiện biểu hiện phytaza thì đều công bố 30
o
C là nhiệt độ thích hợp
nhất cho E. coli biểu hiện phytaza (Kerovuo et al., 1998, Kim et al
1998). Chính vì vậy, chúng tôi cũng đã chọn 30
o
C làm nhiệt độ thích hợp
để biểu hiện PhyC tái tổ hợp.
ảnh hởng của IPTG
Bên cạnh yếu tố nhiệt độ ảnh hởng đến sự biểu hiện phytaza của
chủng tái tổ hợp, chất cảm ứng cũng tác động trực tiếp đến khả năng sinh
tổng hợp enzym này. IPTG là chất cảm ứng đối với promotơ T7 lac.
Promotơ này điều khiển trực tiếp quá trình biểu hiện gen phyC. Theo một
số tác giả, nồng độ IPTG dùng để cảm ứng biểu hiện PhyC tái tổ hợp
trong E. coli là 1 mM, 1,5 mM (Kim et al., 1998, Miksch et al., 2002)
Zinin et al., 2004). Nhng IPTG có giá thành rất cao nên việc khảo sát để
tìm ra nồng độ IPTG thích hợp nhằm giảm chi phí sản xuất là điều rất cần
thiết. Chính vì vậy, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hởng của dải nồng độ
IPTG từ 0 - 2000 M đến lợng phytaza đợc tạo thành.

Kết quả khảo sát chỉ ra rằng ở mẫu không cảm ứng và cảm ứng với
nồng độ IPTG là 10 M, lợng sinh khối tế bào cao nhng phytaza đợc
tổng hợp ra lại rất thấp. Điều này đợc giải thích là do chất cảm ứng IPTG
ở nồng độ 10 M không đủ để kích hoạt promotơ T7 lac nên chủng biểu
hiện vẫn sinh trởng, phát triển bình thờng. Ngợc lại, ở các mẫu đợc
cảm ứng với nồng độ IPTG cao hơn từ 100 M đến 2000 M, thì lợng
PhyC tái tổ hợp thu đợc nhiều hơn và sinh khối tế bào ít hơn. Điều này
xảy ra có thể là do promotơ T7 lac bị cảm ứng nên từ đó tế bào tập trung
vào quá trình biểu hiện PhyC tái tổ hợp nhiều hơn là sinh trởng. Lợng

phytaza nếu đợc thu sớm sẽ cha đạt đến mức tối đa, nhng nếu để thu
muộn lợng enzym đợc tổng hợp ra có khi lại bị giảm vì trong quá trình
lên men dài sẽ sinh ra một số chất làm ảnh hởng đến sản lợng của
chúng.
Chính vì vậy, để xác định đợc thời điểm thu mẫu thích hợp mà tại
đó lợng phytaza đợc tổng hợp cao nhất, chúng tôi đã tiến hành khảo
sát trong khoảng thời gian từ 0 đến 5 giờ sau khi cảm ứng. Kết quả khảo
sát đợc thể hiện trong hình 3.24.
Nhìn chung, lợng phytaza thu đợc tăng dần theo thời gian và ổn
định từ giờ thứ t trở đi, sau đó không tăng thêm ở giờ thứ 5 và nếu kéo
dài thời gian lên men, lợng phytaza thu đợc còn có thể bị giảm đi do
quá trình lên men đã tạo ra các chất ức chế (Hình 3.24). Chính vì những
nguyên nhân trên, để không làm ảnh hởng đến chất lợng cũng nh giá
thành sản phẩm, chúng tôi đã chọn thời điểm thu mẫu thích hợp là 4 giờ
sau khi cảm ứng.
kDa
116
66

45
35


Hàm lợng protein tinh sạch trong các phân đoạn thu đợc nằm
trong khoảng 125-153 g/ml. Enzym đã đợc tinh sạch có hoạt độ riêng
là 52,28 U/mg. Lợng protein này đợc sử dụng để xác định các tính
chất của enzym.
3.7.2 Xác định tính chất của PhyC tái tổ hợp
ảnh hởng của pH đến hoạt độ và độ bền của PhyC tái tổ hợp
Nhìn chung, PhyC tái tổ hợp có khả năng hoạt động mạnh trong
khoảng pH từ 5,5-7 và enzym này hoạt động tối u ở pH 6,5 và khá bền
trong khoảng pH từ 5,5-6,5. Chính vì PhyC tái tổ hợp hoạt động tốt ở pH
1 2 3 4
kDa
116
66

45
35
25

18,4 14,4
Hình 3.26. PhyC tái tổ hợp sau khi tinh

o
C, enzym này
không bị mất hoạt tính trong thời gian 20 phút từ nhiệt độ 55
o
C trở
xuống và hoạt độ enzym vẫn còn 85% sau 20 phút ủ ở 60
o
C (Hình 3.28). 0
20
40
60
80
100
120
33.544.555.566.577.588.59
pH
Hoạt độ tơng đối (%)
0

Hoạt độ còn lại (%)
Hoạt độ phytaza
Độ bền phytaza

21

ảnh hởng của các ion kim loại và chất khử đến PhyC tái tổ hợp
ảnh hởng của ion kim loại và chất khử đến hoạt độ PhyC tái tổ
hợp đợc kiểm tra bằng cách sử dụng natri phytat làm cơ chất.
Bảng 3.12. ảnh hởng của ion kim loại và chất khử đến hoạt độ
PhyC
Ion kim loại Hoạt độ PhyC tơng đối (%)
Đối chứng 100
MgCl
2
86
MnCl
2
55
CaCl
2
100
CuCl
2
9
NiCl
2
16
EDTA 4
Hoạt độ của PhyC tái tổ hợp bị giảm mạnh mẽ khi có mặt EDTA và


ảnh hởng của tripsin và pepsin đến PhyC tái tổ hợp
PhyC tái tổ hợp không bị tác động bởi tripsin bởi vì khi ủ enzym
này với tripsin trong 1 giờ, hoạt độ PhyC tái tổ hợp vẫn còn lại là 100%.
Trong khi đó, PhyC tái tổ hợp lại mẫn cảm với pepsin vì hoạt độ PhyC
còn lại sau khi xử lý với pepsin chỉ còn 23%. Trong khi đó, Papp -
phytaza tái tổ hợp đợc sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Pseudomonas putida
thì lại bị bất hoạt bởi enzym này (Dharmsthiti et al., 2005).

Ngoài ra, PhyC tái tổ hợp cũng mẫn cảm với pepsin vì hoạt độ
PhyC còn lại sau khi xử lý với pepsin trong 1 giờ chỉ còn 23%. Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp kết quả nghiên cứu của Kerovuo
et al., 1998 khi cho rằng phytaza của B. subtilis VTT E-68013 bị bất hoạt
bởi pepsin.
Mặc dù PhyC bị bất hoạt bởi pepsin nhng xu hớng chung hiện
nay là sản xuất những chế phẩm đa enzym cho nên việc kết hợp giữa
phytaza của nấm mốc với phytaza của vi khuẩn sẽ giải quyết đợc vấn đề
trên.
Động học enzym
Giống nh hầu hết các phytaza của Bacillus, PhyC tái tổ hợp trong
luận án này cũng tuân theo phơng trình của Michaelis-Menten. Giá trị
K
m
, V
max
của PhyC tái tổ hợp đợc xác định là 0,48 mM và 180
mol/phút. Trong khi đó giá trị K
m
của phytaza đối với natri phytat của
Bacillus sp. DS11 là 0,55 mM và B. subtilis natto đợc báo cáo là 0,5

B1 trong vi khuẩn E. coli. ở các điều kiện nhiệt độ 30
o
C, nồng độ chất
cảm ứng IPTG 100 M, thời gian thu mẫu là 4 giờ sau cảm ứng đã
cho thu đợc lợng PhyC tái tổ hợp là 288 mg/l, lớn hơn 48 lần so với
phytaza từ chủng tự nhiên.
5. PhyC tái tổ hợp có nhiệt độ tối u là 55
o
C, pH tối u là 6,5. Giá trị K
m

= 0,48 mM, V
max
= 180 mol/phút, hoạt độ riêng là 52,28 U/mg.
Enzym này bị ức chế mạnh bởi EDTA, ion Cu
2+

và bền với tripsin.

Kiến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu một số điều kiện ảnh hởng đến quá trình sinh
tổng hợp phytaza từ chủng E. coli tái tổ hợp nh là sử dụng lactoza để
thay thế cho chất cảm ứng IPTG đắt tiền, lên men bán liên tục để thu
nhận đợc lợng lớn phytaza.
2. Nghiên cứu đa gen phyC mã hóa cho phytaza từ B. subtilis B1 trên
vào hệ biểu hiện nấm men nhằm dễ dàng thu nhận PhyC tái tổ hợp.