BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Tên đề tài:

Nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp
Giai đoạn 1: Thiết kế vector và chọn tế bào biểu hiện Insulin

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lê Văn Phủng
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường đại học Y Hà Nội
Mã số đề tài (nếu có):

3
MỤC LỤC

Nội dung Trang
Đặt vấn đề 5
Chương 1: Tổng quan 6
1. Tình hình mắc bệnh đái tháo đường 6
2. Insulin 7
Lịch sử phát hiện 7
Cấu trúc phân tử 9
Quá trình hình thành insulin trong cơ thể 10
Cơ chế tác động của insulin 11
Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp 13
Nhu cầu insulin hiện nay 16
Pre-proinsulin và Proinsulin 18

Chương 4: Bàn luận 45
Kết luận 47
Kiến nghị 47
Tài liệu tham khảo 48
5
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường là bệnh được quan tâm từ lâu trên toàn thế giới vì gánh
nặng cho gia đình và xã hội mà nó gây ra.
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 263 triệu người mắc bệnh đái tháo
đường và con số này tiếp tục tăng lên. Ước tính đến năm 2025, con số này sẽ
lên tới 330 triệu người (gần 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ bệnh tăng lên (so với
hiện nay) ở các nước phát triển là 42%, như
6
Chương 1. TỔNG QUAN
1. Tình hình mắc bệnh đái tháo đường
Định nghĩa: Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) hay bệnh tiểu đường là một nhóm
các bệnh chuyển hoá được đặc trưng bởi tăng glucose máu mạn tính do hậu quả
của thiếu hụt hoặc giảm hoạt động của insulin hoặc kết hợp cả hai [3, 4].
Phân loại (1999): Theo phân loại đang dùng chính thức và đượ
c chấp nhận
rộng rãi hiện nay [3, 4], bệnh ĐTĐ được phân làm 2 nhóm:
Bệnh đái tháo đường týp 1: Thiếu insulin do tế bào β bị phá huỷ, thường
thiếu hụt insulin tuyệt đối. Nguyên nhân của hiện tượng phá huỷ tế bào β
thường là do tự miễn dịch (qua trung gian tế bào), cũng có khi không tìm thấy
nguyên nhân (vô căn).
Bệnh thường gặp ở người trẻ tuổi (< 35 tuổi), lứa tuổi hay gặp nhấ
t là 10 -
16 tuổi (Michael J. Fowler et al., 2007). Đây là một dạng bệnh nặng, trong đó
các tế bào có nhiệm vụ tiết insulin của tuyến tụy bị phá hủy nên cơ thể không có
insulin để sử dụng. Nếu không điều trị kịp thời và đúng đắn, bệnh nhân sẽ bị
nhiều biến chứng nặng và dẫn đến tử vong (Rother et all., 2007).
Bệnh đái tháo đường týp 2: Do kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo
giảm ch
ức năng tế bào β, riêng rẽ hoặc kết hợp cả hai.
Đái tháo đường type 2 là loại đái tháo đường “không phụ thuộc insulin”.
Bệnh thường gặp ở người trên 40 tuổi, người béo phì, trong đó cơ thể vẫn sản
xuất insulin nhưng không sử dụng được, gọi là hiện tượng kháng insulin
(Michael J. Fowler et al., 2007) hoặc sử dụng kém hiệu quả. Bệnh diễn biến từ
từ, có khi không có triệu chứng gì và chỉ
được phát hiện tình cờ qua khám sức

Biến chứng và hậu quả của đái tháo đường:
Nếu không được phòng và chữa kịp thời, bệnh ĐTĐ dễ gây biến chứng.
Có thống kê đã cho thấy: 44% người bệnh đái tháo đường bị biến chứng thần
kinh, 71% có biến chứng về thận, 8% bị biến chứng mắt (giảm thị lực, có thể
dẫn đến mù lòa). Các biến chứng thường gặp khác có th
ể kể ra sau đây [3, 8]:
- Tim mạch: có thể gây đột quị, rối loạn tuần hoàn ngoại vi.
- Suy giảm tình dục, liệt dương.
- Hoại tử chi: có thể phải cắt cụt.
- Nhiễm trùng cơ hội.
Các yếu tố nguy cơ đối với bệnh ĐTĐ:
- Tiền sử gia đình có liên quan với bệnh ĐTĐ.
- Tiền sử s
ản khoa, thai kỳ.
- Chỉ số BMI cao, thừa cân, béo phì, vòng eo lớn.
- Tăng huyết áp.
- Ít hoạt động thể lực.

2. Insulin
Lịch sử phát hiện
Năm 1869, Paul Langerhans [9], một sinh viên ở Viện giải phẫu bệnh
Berlin, khi học cấu trúc của tuỵ dưới kính hiển vi, đã phát hiện ra rằng, có một
số đám nhỏ tế bào (“little heaps of cells”; về sau gọi là islets of Langerhans,
tiểu đả
o Langerhans) chưa thấy có tài liệu nào mô tả. Phát hiện này đã được
nhiều nhà nghiên cứu thời đó chú ý, đặc biệt là về mặt cấu trúc và chức năng
của chúng.

8
Về cấu trúc, người ta nhận thấy, chúng không có các đường thông với các

thể làm tắc một số độ
ng mạch của tuỵ để làm teo phần lớn nhu mô tuỵ nhưng
không ảnh hưởng tới các đảo Langerhans. Ông nghĩ rằng, có thể làm teo như
thế để thu lấy chất tiết tương đối thuần khiết từ các đảo này. Ông đã thực hiện
thành công ý tưởng này tại trường đại học Toronto (Canada) và sau này, ông đã
được nhận giải thưởng Nobel về công trình này [15]. Khi các tế bào “tiêu hoá”
của tuỵ bị phá huỷ, hàng nghìn đảo Langerhans vẫn còn l
ại, nhóm nghiên cứu
đã thu được chất tiết ra từ các đảo (islet) này, họ gọi tên là isletin (chất mà hiện
nay gọi là insulin). Dùng isletin tiêm cho những con chó đã bị cắt tuỵ, nhóm
nghiên cứu đã giữ được cho chúng sống trong vài tháng; trong khi đó, những
con chó không được tiêm thì chết rất nhanh.

9
Khi động vật bị lấy mất tuỵ, nồng độ glucose máu tăng cao, một hình ảnh
giống như bệnh đái tháo đường. Nhóm nghiên cứu này, về sau, phối hợp với
James Collip [14], nhà hoá sinh, đã thành công trong tinh chế isletin và tiến
hành thử lâm sàng.
Ngày 11 tháng 01 năm 1922, bệnh nhân (Leonard Thompson, 14 tuổi) đái
tháo đường đầu tiên, nằm ở bệnh viện đa khoa Toronto, đã được tiêm insulin.
Tuy nhiên, insulin này chưa được tinh chế tốt nên Thompson đã bị dị ứng n
ặng
và việc tiêm bị tạm dừng. Mười hai ngày tiếp theo, Collip đã làm việc suốt ngày
đêm để cải tiến quy trình tinh sạch insulin và đã thu được insulin với chất lượng
cao hơn. Đến ngày 23/01/1922, liều thứ 2 đã được tinh chế xong và lại được
dùng cho bệnh nhân. Kết quả thử lần này thật hoàn hảo, hầu như không có tác
dụng phụ nào và nó đã làm hết hoàn toàn đường niệu của bệnh nhân.
Năm 1922, Best [14] đã c
ố gắng cải tiến các kỹ thuật của mình để có thể
thu được một lượng lớn hơn insulin, đáp ứng cho nhu cầu điều trị cấp bách của
Hình 1: Cấu trúc phân tử insulin người
Phân tử insulin gồm hai chuỗi polypeptide: chuỗi A, 21 amino acid và chuỗi B, 30 amino
acid. Hai cầu disulfur (A7 - B7, A20 - B19) là các liên kết đồng hóa trị; cầu thứ 3 nằm trong
chuỗi A (6-11) Quá trình hình thành insulin trong cơ thể (Sơ đồ 1)
Insulin được tạo ra từ tiền thân của nó là proinsulin. Phân tử insulin hoạt
động được tạo thành từ protein tiền thân này bằng quá trình thủy phân protein
(proteolytic) dưới tác dụng của các enzym trypsin của tuyến tụy
(endopeptidases PC1, PC2, PC3) [25]. Cuối cùng, insulin được đóng gói và
chứa trong các hạt tiết tích tụ trong tế bào chất cho đến khi được kích hoạt để
giải phóng. Quá trình này gồm hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Thủy phân
để cắt đoạn peptide tín hiệu, gồm 23 axit amin ở
đầu amin tự do của pre-proinsulin để tạo thành phân tử proinsulin chứa ba liên
kết cầu disulphur.
Giai đoạn 2: Thủy phân tiếp để cắt rời đoạn peptid C (35 acid amin) để tạo
thành phân tử insulin hoàn thiện (có hoạt tính), bao gồm 51 acid amin, thực
hiện chức năng của nó trong cơ thể [26].
Có thể tóm tắt quá trình hình thành insulin trong cơ thể theo sơ đồ dưới
đây:

11
Sơ đồ 1: Các bước hình thành insulin


Sơ đồ 2: Tác động của insulin tới sự hấp thu glucose
Insulin gắn vào receptor của nó (1) rồi hoạt hoá nhiều hệ protein (2). Những protein này
gồm chuyển vị trí của Glut-4 transporter đến màng sinh chất và thu nhận glucose (3), tổng
hợp glycogen (4), phân huỷ glycogen (5) và tổng hợp acid béo (6)[29]
Insulin đóng vai trò quan trọng trong toàn bộ quá trình chuyển hoá
carbonhydrat, lipid, protid, sinh ra năng lượng duy trì quá trình hoạt động và
phát triển của cơ thể [2].
Trên chuyển hoá glucose: Tác dụng hạ đường huyết do làm tăng tính
thấm của màng tế bào đối với glucose, làm glucose vận chuyển vào trong tế bào
dễ dàng [2, 28], thúc đẩy tổng hợp glycogen ở gan, do hoạt hoá hexokinase và
glycogen synthase, đồng thời ức chế huỷ glycogen ở gan do ức chế
phosphorylase [2, 22], ức chế tân tạo glucose ở gan, do đó làm giảm nguyên
liệu tạo glucose [2, 8], tăng dự trữ và sử dụng glucose ở gan, cơ và mô mỡ [2,
22].
Trên chuyển hoá lipid: Làm giảm acid béo tự do trong vòng tuần hoàn và
thúc đẩy dự trữ tryglycerid ở mô mỡ [2, 23].
Trên chuyển hoá protid: Làm tăng tổng hợp protein do tăng thu nhận acid
amin vào tế bào và kích thích hoạt tính của ribosome, ức chế quá trình oxi hoá
acid amin, ức chế sự giáng hoá protein ở cơ và các mô khác, do đó giảm hầu hết
các acid amin trong máu. Đồng thời ức chế tân tạo glucose từ acid amin [22],
[23].

Trên chuyển hoá năng lượng: Insulin đóng vai trò quan trọng trong việc
duy trì và điều hoà chuyển hoá năng lượng [28]. 13
Công nghệ sản xuất Insulin tái tổ hợp
Hiện nay, có nhiều kỹ thuật sản xuất insulin tái tổ hợp, nhưng tất cả đều

Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục trong các điều kiện tối ưu nhằm
kích thích vi khuẩn sinh sản tối đa để thu được nhiều sinh khối nhấ
t.
Bước 5: Tiền tinh sạch.
Sau lên men, tiến hành tách tế bào và khử trùng bằng nhiệt. Dùng
lysozyme để phá vỡ màng tế bào, sau đó dùng một hỗn hợp chất tảy rửa để tách
lớp màng lipid. Proinsulin được tách ra khỏi các mảnh vỡ tế bào bằng phương
pháp ly tâm và lọc.
Bước 6: Hoạt hoá.

14
Hệ thống E. coli có khả năng biểu hiện insulin nhưng không có khả năng
hoạt hoá in vivo. Do đó phải thực hiện quá trình hoạt hoá insulin bằng cách xử
lý với các dung dịch đệm, giúp nó đạt được cấu trúc bậc 4; sau đó, dùng
enzyme đặc hiệu, trypsin, để phân cắt proinsulin. Khi đó, sản phẩm thu được
mới có hoạt tính cần thiết.
Bước 7: Tinh sạch insulin.
Thường dùng phương pháp sắc ký, tách, các kỹ thuật bộ
c lộ sự khác nhau
về điện tích, kích thước và ái lực đối với nước của phân tử sắc ký như sắc ký
trao đổi ion, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lọc gen. Quá trình sắc ký được
giám sát bằng cách phân tích các protein đặc hiệu nhờ ELISA. Độ tinh sạch của
insulin được đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian trong quá trình sản xuất nhờ
những phòng thí nghiệm chuyên nghiệp. Cuối cùng, insulin được tinh thể hoá.
Phương pháp thứ 2:
Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.
Phương pháp này tránh được phải sản xuất các enzyme đặc hiệu cần thiết
để biến proinsulin thành insulin. Nhà sản xuất chỉ cần 2 gen nhỏ: một gen cho
chuỗi A, một gen cho chuỗi B. Do đã biết trình tự chính xác của 2 gen này nên
có thể tổng hợp được chúng. Mỗi phân tử ADN sau đó được chèn vào các

- tiền insulin, thành insulin có hoạt tính. Insulin người, sản xuất bằng k
ỹ thuật
ADN tái tổ hợp, lần đầu tiên trên thế giới, đã được đưa ra thị trường với tên
thương phẩm là Humulin [33].
- Năm 1987, tổng hợp insulin thành công trong tế bào nấm men [34].
Tình hình sản xuất insulin tái tổ hợp trong nước:
Ở Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về sản xuất insulin tái tổ hợp
nhưng chỉ dừng lại ở mức độ tiếp cận như
trường đại học Y Hà Nội [35, 36],
đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh [37-41]. Trung tâm Công nghệ Sinh học
thành phố Hồ Chí Minh đã mô hình hóa thành công một quy trình sản xuất
insulin và đang thử nghiệm sản phẩm trên động vật [38]. Chưa có cơ sở nào
thực sự sản xuất được insulin, ngay cả ở quy mô phòng thí nghiệm.
Tình hình sản xuất insulin trên thế giới:
Từ năm 1977, Eli Lilly đã dùng phương pháp hoá học để biến đổi tiền
insulin thành insulin có hoạt tính và loại insulin này đã trở thành thuốc sản xuất
bằng công nghệ gen đầu tiên được cấp phép dùng cho người [33]. Đến những
năm 90, quy trình này được cải tiến nhờ thay E. coli bằng nấm men
Saccharomyces cerevisiae, loại nấm này có khả năng biến đổi sản phẩm sau quá
trình dịch mã, nhờ vậy, quá trình sản xuất insulin đơn giản hơn [2].
Nhiều nước đã sản xuất insulin tái tổ hợp, như M
ỹ, Đức, Pháp. Tuy vậy,
tất cả các nước đều có bản quyền riêng mà ở nước ta, chưa thấy có tổ chức nào
đứng ra mua một trong các bản quyền này [2].

Về công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp:
Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại đều
dựa trên các chủng nấm men hoặc vi khuẩn như đã nói ở trên, kết hợp với các
kỹ thuậ
t gen để sản xuất insulin người. Người ta nuôi cấy các chủng này trên

Nhu cầu insulin hiện nay
Trước khi khám phá ra hoạt động của insulin, bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ
không có cơ hội có một cuộc sống khoẻ mạnh, đặc biệt là bệnh nhân ĐTĐ typ I.
Ngày nay, số người sử dụng insulin sản xu
ất bằng kỹ thuật di truyền ngày một
tăng. Năm 1996, ở Mỹ chi phí cho điều trị ĐTĐ là 90 tỷ USD [1, 2]. Theo hãng
Eli Lilly, năm 2001, 95% số bệnh nhân ĐTĐ trên thế giới đã sử dụng insulin
người.
Các nước phát triển đã dùng insulin tái tổ hợp thay cho insulin có nguồn
gốc động vật. Hầu hết các công ty lớn đã ngừng hẳn việc sản xuất insulin động
vật do nhữ
ng nhược điểm đáng kể của nó so với insulin tái tổ hợp.
Năm 2005, nhu cầu insulin dùng trong trị bệnh đái tháo đường ước tính
khoảng 4.000 đến 5.000 kg và dự kiến năm 2010 là 16.000 kg. Nhu cầu về
insulin của thế giới vượt qua con số vài tấn/năm và vì thế nguồn cung cấp
insulin cho điều trị bệnh đái tháo đường đang thiếu hụt. Từ những thập niên
1920 cho đến những nă
m đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách

17
tách chiết từ tuyến tụy của động vật như heo và bò. Tuy nhiên, insulin người có
sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi
A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B). Do đó
gây ra những tác dụng không mong muốn (dị ứng) khi sử dụng insulin dạng
này. Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều
khó khăn. Sau đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo
và bò đã
được phát triển bằng cách sử dụng phản ứng chuyển peptide
(transpeptidation). Insulin người được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên
tại Công ty Genentech (Mỹ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm

18
Pre-proinsulin và Proinsulin
Cấu trúc phân tử của pre-proinsulin và proinsulin (Hình 2): Hình 2. Sơ đồ cấu tạo và trình tự amino acid của proinsulin
Proinsulin được hình thành từ pre-proinsulin. Pre-proinsulin là một chuỗi
peptid dài có 109 amino acid, gồm 4 chuỗi peptid ngắn: chuỗi peptid tín hiệu
(signal peptide), chuỗi peptid B, C và A. Ở tế bào chất, pre-proinsulin bị thuỷ
phân, tách ra peptid tín hiệu ở đầu N tận, gồm 23 acid amin. Phần còn lại là
proinsulin có cấu tạo chuỗi polypeptid đơn gồm 86 acid amin.
Phân tử proinsulin tương đối nhỏ, có khối lượng khoảng hơn 6000 dalton,
được cấu tạo bởi 3 chuỗ
i peptid A, B, và C. Chuỗi A gồm 21 acid amin, chuỗi
B gồm 30 acid amin liên kết với nhau bằng hai cầu nối disulphur và chuỗi
peptid C gồm 35 acid amin, còn gọi là chuỗi peptid nối. Việc định lượng peptid
C cho biết lượng insulin trong máu là nội sinh hay ngoại sinh, cũng có tác dụng
phân biệt giữa ĐTĐ týp I và ĐTĐ týp II [23].
Gen mã hoá proinsulin:
Nghiên cứu bộ gen người cho thấy, gen mã hoá proinsulin cũng như
insulin nằm ở nhiễm sắc thể số 11, trên cánh ngắn (11p) gắn gen IGF và gen β -
globin. Gen proinsulin đã được tách, t
ạo dòng và giải trình tự vào những năm
70 của thế kỷ XX, gồm 2 vùng: vùng mang mã di truyền (coding region) và
vùng không mang mã di truyền (no coding region).
Vùng mang mã di truyền có kích thước 1430 bp, có 2 intron, intron thứ
nhất nằm giữa đoạn trình tự mã hoá chuỗi peptid tín hiệu và chuỗi peptid B;
intron thứ 2 nằm giữa đoạn gen mang mã di truyền mã hoá chuỗi peptid C.

19

đã được biến đổi nhằm tạo insulin dễ dàng hơn, như nghiên cứu của Chol Soo
Shin Seung năm 1997, G. Chang năm 1998 tạo mini-proinsulin [49]. Năm
2003, C.W Hayo đã biểu hiện proinsulin có các điểm cắt đặc hiệu cho việc tạo
insulin thu
ận lợi hơn. Cũng trong năm 2003, proinsulin người đã được Zhi -
Song Qiao biểu hiện và nghiên cứu cả quá trình sắp xếp lại cấu trúc (refolding)
sau biểu hiện [50].
Một số nghiên cứu proinsulin ở Việt Nam:
Một nghiên cứu được công bố của Trường Đại học Khoa học tự nhiên,
Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh, với sự kết hợp của công ty

20
Ajinomoto. Đó là nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin của người
tái tổ hợp trong E. coli. Các tác giả đã biểu hiện thành công mini-proinsulin,
nhưng chưa nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của protein này sau biểu
hiện và về các điều kiện tối ưu trong quá trình biểu hiện [37, 38, 40, 41]. Từ
năm 2007, trường đại học Y Hà Nội cũng đã nghiên cứu và biểu hiện thành
công proinsulin [35, 36].

ủa hãng Ambion, Mỹ (Catalog
#: AM3322, Human pancreas cDNA, Ambion Inc, USA).
- Mồi (5’-3’):
Pins-Fw: cgc gga tcc atg ttt gtg aac caa
Pins-Rv: ccg ctc gag gtt gca gta att ctc
- Vector biểu hiện: pET 28a (+) (Novagen, pET-28a ADN, Catalog #:
69864-3).
pET28a (+) có kích thước 5369 bp, có điểm khởi đầu phiên mã của
pBR322, gen kháng kanamicin, chứa promoter lac được cảm ứng bằng IPTG
(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) khi biểu hiện (Sơ đồ 3). Sơ đồ 3: Sơ đồ cấu tạo pET28a(+)

22
Vùng đa tách dòng (multi-cloning site, mũi tên đậm ngược chiều kim đồng hồ) chứa các vị trí
cắt của BamH I và Xho I.

- Chủng tế bào E. coli DH5a [F -end A1 hsdR17 (rk/mk) supE44 thi
λ
-
recA1
gyrA96
∆
lacU169 (
Φ
80 lacZ∆M15)] (Catalog #: DA-10, MCLAB) được dùng
làm chủng để nhân bản plasmid. Chủng E. coli BL21 (DE3) [F -, ompT, hsdS
(r
B

hạn BamHI và XhoI.
- Điện di sản phẩm phản ứng trên gel agarose 1,5%
- Xử lý băng sản phẩm (lý thuyết): cắt băng sản phẩm trên gel và tinh
sạch bằng bộ kít Gel extraction kit của QIAGEN. S
ản phẩm thu được sau tinh
sạch chính là sản phẩm của sự nối ghép tạo giữa pET28a với gen proinsulin tại
các vị trí cắt của BamHI và XhoI.
1.2.3. Tạo dòng E. coli DH5a mang plasmid tái tổ hợp
Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào E. coli DH5a bằng phương
pháp sốc nhiệt (42
o
C trong 42 giây). E. coli mang plasmid tái tổ hợp được sàng
lọc bằng cách cấy trên môi trường thạch có kanamicin 50 µg/ml. Tách chiết
plasmid này bằng phương pháp Birnboin [51]. Plasmid thu được, được ký hiệu
là pET-PINS.
1.2.4. Tuyển chọn thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự gen

23
Những khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch có kanamicin 50 µg/ml là
những khuẩn lạc có mang plasmid, chọn vài khuẩn lạc để kiểm tra bằng PCR
với chu trình như trên, điện di sản phẩm trên gel agarose 1,5% và thang ADN
100 bp để kiểm tra sản phẩm, PCR cho kết quả dương tính với proinsulin thì
khuẩn lạc đó có chứa plasmid tái tổ hợp. Khi một khuẩn lạc nào đó được xác
định là có mang plasmid tái tổ hợp mong đợi (mang gen proinsulin) thì cấ
y
chuyển chúng sang môi trường LB để thu sinh khối, tách plasmid bằng
QIAprepSpin Miniprep Kit (QIAGEN). Plasmid tái tổ hợp được giải trình tự
theo phương pháp Sanger [21] với BigDye terminator v3.1 của Applied
Biosystems. Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự proinsulin chuẩn
bằng phần mềm BLAST.


2. Đối với insulin: chuỗi A, B
Chiến lược (Sơ đồ 4) 24

Sơ đồ 4: Chiến lược sản xuất insulin theo hướng “hai chuỗi”
2.1. Vật liệu
- Vector tái tổ hợp pET14bInsA chứa chuỗi A và pET14bInsB chứa
chuỗi B được thiết kế và xác định ở trường đại học tổng hợp Osaka, Nhật Bản
(Sơ đồ 5).

25

Sơ đồ 5: Sơ đồ cấu tạo vector pET14b
Vector này chứa các vị trí cắt đặc hiệu của NcoI và BamHI
- Vector pET32c (Novagen) được cài chuỗi A, B lấy từ pET14bIns tại
Viện Công nghệ sinh học (Sơ đồ 6):

Sơ đồ 6: Sơ đồ cấu tạo vector pET32
- Chủng tế bào E. coli DH5a [F -end A1 hsdR17 (rk/mk) supE44 thi
λ
-
recA1
gyrA96
∆