1 NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ VECTOR
ADENOVIRUS ĐỂ SẢN XUẤT VẮC-XIN CHO ĐỘNG VẬT
TRÊN MÔ HÌNH GEN KHÁNG NGUYÊN VP2
(VIRUS PROTEIN 2) PHÒNG BỆNH GUMBORO
MÃ SỐ: KC04.24/06-10
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Thanh Hòa
8571

Hà Nội - 2010

ii
MỤC LỤC
Tr

MỤC LỤC
i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA


7
2.1.2. Tình hình nghiên cu công ngh adenovirus tái t hp hin nay 13

2.1.3. ánh giá công ngh thit k adenovirus làm khung vector cho
phát trin vacxin tái t hp
15
2.2.
Nguyên liệu cơ bản cho công nghệ thiết kế để tạo adenovirus tái
tổ hợp làm vacxin

17
2.2.1. Plasmid cha DNA h gen ca adenovirus vector 17
2.2.2. Plasmid con thoi (shuttle plasmid) hay plasmid trung gian 18
2.2.3. H thng t bào vi khun E. coli  ng nhim 19
2.2.4. H thng t bào ng vt tr giúp kin to adenovirus tái t hp 20
2.3.
Mô tả công nghệ adenovirus tái tổ hợp mà đề tài nghiên cứu
21
2.3.1. t vn  21
2.3.2. i vi h thng Had5 22
2.3.3. i vi h thng Fad9 25
2.4.
Tình hình nghiên cứu vacxin phòng bệnh Gumboro và ý nghĩa
của phát triển vacxin thế hệ mới trên nền adenovirus làm vector

25
2.4.1. Gii thiu virus gây bnh Gumboro 25
2.4.2. Vacxin truyn thng phòng bnh Gumboro 28
2.4.3. Vacxin th h mi phòng bnh Gumboro 30

41
3.1.8. Virus vacxin sn xut trên môi trng t bào gan phôi gà 42

3.1.9. Các loi hóa cht, sinh phm, dng c nuôi cy t bào thông
dng
42
3.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU 43
3.2.1. Phng pháp tip truyn virus Gumboro 43

3.2.2. Phng pháp tách chit và tinh sch RNA h gen ca virus
Gumboro
43

3.2.3. Phng pháp RT-PCR và tách dòng  lu gen kháng nguyên
VP2 ca Gumboro
43

3.2.4. Phng pháp gii trình t xác nh chui gen hoc kim tra kt
qu
44

3.2.5. Phng pháp thit k mi chuyên bit c hiu VP2  thu
nhn “hộp gen kháng nguyên VP2“
45

3.2.6. Phng pháp tách dòng trong E. coli và tách chit DNA
plasmid tái t hp
46

3.2.7. Phng pháp thit k và gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào

bng phn ng trung hòa trên t bào gan phôi gà
58
3.2.17. Phng pháp kim tra min dch ca vacxin bng ELISA 60

Phần thứ tư KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI
TỔ HỢP ĐỐI VỚI HỆ THỐNG FAD9 GIA CÂM
63
4.1.
TÓM LC KT QU NGHIÊN CU CÔNG NGH
ADENOVIRUS FAD9 GIA CM
63
4.2. KT QU THU NHN VÀ CHUN B NGUN GEN VP2 65

4.2.1. Kt qu tip truyn ging virus Gumboro  cung cp ngun
gen VP2
65
4.2.2. Kt qu phân lp và tách dòng lu gi gen VP2 66

iv
4.3.
THIT K VÀ GÀI “HP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2” (CMV-
KOZAK-VP2-PolyA) VÀO PLASMID TRUNG GIAN pL2.4
68

4.3.1. Thit k và thu nhn “hp gen kháng nguyên VP2“ (CMV-
KOZAK-VP2-PolyA)
68

4.5.6. Kt qu kim tra bng phn ng HA phát hin virus Newcastle 87
4.6.
NGHIÊN CU CÔNG NGH T BÀO GAN PHÔI GÀ SN
XUT VÀ KIM TRA GING VÀ VACXIN FAd9-VP2-L VÀ
FAd9-VP2-R
88

4.6.1. Kt qu thc hin công ngh t bào  sn xut virus làm
vacxin
88

4.6.2. Kt qu kim tra kh nng nuôi cy virus ging FAd9-VP2 trên
t bào gan phôi gà
90

4.6.3. Kt qu sn xut ~5.000 liu adenovirus tái t hp trên t bào
gan phôi gà
93

4.6.4. Kt qu kim tra an toàn vô trùng, hiu lc và phân b virus
trong các c quan  gà c a vacxin
98
4.7.
KIM TRA MIN DCH CA VACXIN FAD9-VP2-L VÀ FAD9-
VP2-R BNG ELISA
102
4.7.1. B trí thí nghim 102

4.7.2. Kt qu th nghim adenovirus vacxin vào c th gà bng
ng tiêu hóa (ung), hô hp (nh mi) và tiêm (di da)

124
5.4.1. t vn  v công on gây ng nhim 124
5.4.2. Kt qu thc hin “ng nhim trc tip“ trong E. coli BJ5183 127

5.4.3. Kt qu xây dng phng pháp “ng nhim k tip” vào t
bào BJ5183 ã cha sn pAdEasy1
130

5.4.4. Kt qu thc hin “ng nhim k tip“ DNA pShuttle-CMV-
VP2 vào t bào kh bin BJ5183 mang sn vector pAdEasy1
133

5.4.5. Kim tra plasmid ng nhim tái t hp pAd-Shuttle-VP2 bng
các phng pháp ct enzyme gii hn (EcoRI; PmeI và EcoRI; PacI)
138

5.4.6. Kt qu kim tra pAd-Shuttle-VP2 bng phng pháp sinh hc
phân t và gii trình t
142
5.4.7. Kt lun chung v kt qu to plasmid adenovirus HAd5-VP2 145

Phần thứ sáu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
146

Kết luận
146


CPE Cytopathic Effect Bnh tích t bào
Da/kDa Dalton /Kilodalton n v
tính trng lng phân t protein
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's
Medium
Môi trng nuôi cy t bào
DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic
EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein Protein phát hunh quang xanh lá cây
ELISA Enzym Linked Immunosorbent
Assay
Phn ng hp ph min dch liên kt vi
enzyme
FAd9 Fowl adenovirus type 9 Adenovirus type 9 loài chim
FBS fetal bovine serum Huyt thanh bê
HAd5 Human adenovirus type 5 Adenovirus type 5 ngi
HEK293 Human embryonic kidney cell T bào thn bào thai ngi
IBD Infectious Bursal Disease Bnh viêm túi Fabricius truyn nhim
IBDV Infectious Bursal Disease Virus Virus gây viêm túi Fabricius truyn
nhim
kb Kilobase 1000 cp baz (1 kb = 1000 bp)
LB Luria-Bertani medium Môi trng LB
L-ITR Light inverted tandem repeat Cu trúc lp ngn phía bên trái
LMH Leghorn male hepatoma
(avian hepatocellular carcinoma cell
line)
Dòng t bào u gan gà phát trin t gan gà
trng Lgo (Kawaguchi et al., 1987)
MTA Material Transfer Agreement Th
a thun chuyn giao vt t sinh hc


VP Viral protein Protein ca virus
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH CÓ TRONG BÁO CÁO

Hình Nội dung

Tr
Hình 1.1. S  tóm tt các giai on chính thc hin  tài nghiên cu công
ngh adenovirus vector tái t hp mô hình gen kháng nguyên VP2
trên h thng adenovirus FAd9 gia cm và trên h thng adenovirus
HAd5 ngi 4
Hình 2.1.
Hình thái và cu to ca adenovirus. A. nh kính hin vi in t mô
t các ht adenovirus có dng hình khi sp xp vi nhau to thành
tp hp. B. Mô hình cu trúc không gian ca h
t virion adenovirus 10
Hình 2.2.
Mô hình cu to ht virion adenovirus (ct phng) vi DNA h gen và
13 loi protein c bit hin nay

10


36
Hình 3.3.
S  cu trúc ca plasmid khung pAdEasy-1 mua ca hãng
Stratagene (Stratagene Inc.)
37
Hình 3.4.
S  cu trúc ca plasmid con thoi pShuttle-CMV và vùng a ni
MCS tip nhn DNA ngoi lai (Stratagene)
38
Hình 3.5.
T bào HEK293. (A): Nuôi cy thành mt lp sau 72 h (t >90% ph
áy); (B): nhum hunh quang (Ngun: />); (C): Nuôi
cy mc thành mt lp sau 48 h, do chúng tôi ( tài KC04.24/06-10),
thc hin 39
Hình 4.1.
S  minh ha 8 giai on thc hin  tài (I - VIII), ca ni dung
nghiên cu công ngh adenovirus FAd9 gia cm

64
Hình 4.2
Bnh tích in hình ca túi Fabricius (sng to) và c (xut huyt)  gà
tip truyn

66
Hình 4.3.
Kt qu in di sn phm RT-PCR nhân gen kháng nguyên VP2 ca

Primer và PolyA-dn Primer (B)

73
Hình 4.8.
H gen ca FAdV-9 (FAd9) c thit k to thành plasmid
pPacFAdV-9, cài “hộp gen VP2” vào v trí TR2 to thành plasmid
pFTR2-VP2 (quay trái) hoc pFTR2-VP2inv (quay phi), lây
nhim t bào Hepatoma to giống nguyên gốc FAd9-VP2-L và FAd9-
VP2-R (thc hin ti Canada); chuyn giao ging nguyên gc cho
Vin Công ngh sinh hc, lây nhim t bào gan phôi gà (CEL) tip
truyn giống g
ốc và tạo giống cấp 1  sn xut vacxin FAd9-VP2-L
và FAd9-VP2-R (thc hin ti Vit Nam)
76
Hình 4.9.
T bào mt lp (monolayer): A. Không gây nhim (i chng); B.
Gây nhim virus FAd9-VP2 (nng  10
-3
) có CPE sau 72 gi

79
Hình 4.10
T bào Hepatoma nhim  nng  virus gây nhim là 10
-6

ging

93
Hình 4.17.
ánh giá CPE  xác nh thi im thu hoch virus FAd9-VP2-L
(FADVAC-L) trên t bào gan phôi gà sau 48 h, 72 h, 96 h và 144 h;
có b trí i chng 93
Hình 4.18.
T bào gan phôi gà (CEL) lúc 48 h mt lp (u, mn, trong môi
tr
ng DMEM/FBS)  chun b cy ging virus vacxin FAd9-VP2-
L/R; t bào i chng theo dõi lúc 72h và t bào i chng lúc 144h
 so sánh vi t bào cy ging sn xut vacxin
94
Hình 4.19.
Kim tra thng xuyên hàng ngày các chai t bào gan phôi gà trc
khi cy ging virus và các chai nuôi cy virus và i chng
95
Hình 4.20.
S hy hoi t bào (CPE) ca 3 chai (1, 2, 3) nuôi cy ging virus
vacxin FAd9-VP2-L trên t bào gan phôi gà ti thi im 72h sau gây
nhim,  thu hoch vacxin

x
Hình 5.4.
in di kim tra DNA vector tái t hp pShuttle-CMV-VP2 ct bng
EcoRI. C+: DNA ca pShuttle-CMV ( dài 7,5 kb) làm i chng

120
Hình 5.5.
in di kim tra sn phm vector pShuttle-CMV-VP2 ca 3 chng
GKN-T1ST, GKN-G202 và GQG-52-70

122
Hình 5.6. Trình t nucleotide ti u 5’ và 3’ ca chromatogram gii trình t
mt clone i din ca plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2

123
Hình 5.7.
Minh ha quá trình gây ng nhim trong E. coli 5183 gia DNA ca
plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2 (ct bng PmeI) (1) vi DNA
c
a plasmid adenovirus vector pAdEasy-1 (2),  to nên plasmid
adenovirus tái t hp pAd-Shuttle-VP2 (3), cha các thành phn:
vùng mm ori ca plasmid con thoi và gen kháng kháng sinh
kanamycin (mi tên); hp gen kháng nguyên VP2; và khung
adenovirus HAd5. Vùng mm ori và gen kháng kháng sinh ampicillin
ca plasmid pAdEasy-1 b loi b trong quá trình ng nhim


137
Hình 5.13.
K
t qu in di kim tra DNA plasmid tái t hp pAd-Shuttle-VP2 ct
bng enzyme EcoRI

139
Hình 5.14.
Kt qu in di kim tra DNA plasmid tái t hp pAd-Shuttle-VP2
(clone 1/1; 4/2 và 5/1) ct bng hai enzyme EcoRI và PmeI

140
Hình 5.15.
in di kim tra kt qu DNA ca pAd-Shuttle-VP2(1/1) và pAd-
Shuttle-VP2(5/1) ct bng PacI

141
Hình 5.16.
Kt qu in di sn phm PCR thc hin  kim tra adenovirus tái t
h
p pAd-Shuttle-VP2(1/1); pAd-Shuttle-VP2(4/2) và pAd-Shuttle-
VP2(5/1), vi các cp mi c hiu SHUTF-ADER (~2,6 kb) và
GKPKZF-GV2R (~1,35 kb)
143
Hình 5.17.
Kt qu gii trình t kim tra sn phm PCR thu nhn vùng giao nhau
gia pShuttle-CMV và pAdEasy1 ca pAd-Shuttle-VP2(1/1) cha

Kt qu kim tra vô trùng vi khun và nm 99
Bảng 4.5.
Kt qu kim tra an toàn (100 liu) vi 2 loi vacxin, 3 ng
a vacxin, theo dõi 10 ngày

100
Bảng 4.6.
S liu chi tit ELISA kt qu kim tra ánh giá áp ng min
dch ca gà i vi vacxin FAd9-VP2-R (gi tt là vacxin R) vi
các ng s dng khác nhau 105
Bảng 4.7.
S liu chi tit ELISA kt qu
kim tra ánh giá áp ng min
dch ca gà i vi vacxin FAd9-VP2-L (gi tt là vacxin L) vi
các ng s dng khác nhau 107
Bảng 4.8.
Kt qu ELISA kim tra các mu huyt thanh ca các lô i
chng i vi thí nghim

109
Bảng 4.9.
Tng hp kt qu kim tra ánh giá áp ng min dch ca gà
ca các loi vacxin FAd9-VP2-R (gi t
t là R) và FAd9-VP2-L

n trong giai on 2009 - 2010, vi mt s ch ích
nh sau:
Mục tiêu tổng thể của đề tài: Nghiên cu ng dng công ngh vector
adenovirus tái t hp ln u tiên c thc hin ti Vit Nam, vi mc ích
nhm thit k c h thng adenovirus  làm vacxin cho ng vt, trc ht
là xây dng mô hình gen kháng nguyên VP2 ca virus Gumboro  gia cm, t
ó, có 
c s tip cn công ngh mi cho nghiên cu sn xut vacxin th h
mi và các ch phm hot tính sinh hc th h mi sau này.
Mục tiêu cụ thể của đề tài:
- Có c qui trình công ngh và h thng adenovirus làm vector vacxin.
- Có c ging vacxin sn xut bng công ngh vector adenovirus,  có th
s dng qua ng tiêu hoá (ung/n), hô hp (khí dung), ng tiêm cho gia
cm và có giá tr kinh t
.
- Sn xut th nghim c vacxin phòng chng bnh Gumboro bng công
ngh vector adenovirus làm c s (tin ) cho nhng vacxin virus khác ca gia
súc, gia cm và thu sn, theo công ngh này.

2
Mục tiêu dài hạn sau khi thực hiện xong đề tài:
Trên c s thc hin thành công  tài KC04.24/06-10 vi mô hình gen
kháng nguyên VP2 ca virus Gumboro  gia cm, công ngh vector adenovirus
s c trin khai và a ra c mt loi hình công ngh mi làm c s (làm
tin ) cho nhng vacxin virus khác ca gia súc, gia cm và thu sn, ng dng
thích hp cho mi loi bnh truyn nhim cn phòng chng.
* * *
Có nhiu lo
i adenovirus ngi và ng vt ã c thit k làm h
thng vector dn truyn gen kháng nguyên, trong ó  tài KC04.24/06-10 ã

ồn kháng nguyên không nhân lên (chủ định phụ ca  tài, làm mô
hình   tài nghiên cu các thao tác adenovirus vector tái t hp và to
vacxin, nu cn).
V nguyên liệu thiết kế,  có mt h thng adenovirus cho s dng, cn
có 5 loi nguyên liu chính: i) Plasmid vector adenovirus cha DNA h gen ã
c thit k an toàn, úng ch nh s dng; ii) Plasmid vector con thoi (hay
còn gi là plasmid trung gian)  tip nhn “hộp gen kháng nguyên
” ích, sau
ó, s dng  gây ng nhim vi DNA plasmid vector, to nên mt loi
plasmid tái t hp mang “hộp gen kháng nguyên” ích, chun b cho s kin to
adenovirus tái t hp trong (các) t bào chuyên bit; iii) “Hộp gen kháng
nguyên” ích là on DNA thu nhn có cha toàn b gen kháng nguyên và các
thành phn iu hòa ph tr  hai u ca hp gen (do chúng ta ch ng thit
k); iv)
Hệ thống tế bào vi khuẩn  thc hin ng nhim (c s dng tt
nht hin nay là t bào E. coli dòng BJ5183), hòa nhp DNA plasmid con thoi
tái t hp (on cha cha hp gen kháng nguyên) vi DNA plasmid
adenovirus vector to plasmid adenovirus tái t hp mang gen kháng nguyên
ích; v) Hệ thống tế bào động vật chuyên biệt, là (các) dòng t bào ng vt
c thù khác nhau c s dng  thc hin lây nhi
m (transfection),  trong
t bào ó, các ht adenovirus tái t hp mang hp gen ích s c kin to, 
chn lc làm ging.

V các giai đoạn chính thực hiện vic kin to adenovirus tái t hp mang
gen ích kháng nguyên VP2 (ca virus Gumboro) trên c hai h thng là FAd9
và HAd5  s dng làm vacxin, ã tri qua các giai on sau (Hình 1.1):

4


quyt.
Phân lậpvàlưugiữ gen đích kháng nguyên
VP2 củaGumboroViệtNam
Hệ thống adenovirus
FAd9 gia cầm
Hệ thống adenovirus
HAd5 người
Thiếtkế
“Hộp gen kháng nguyên VP2”
(CMV-Kozak-VP2-PolyA)
Thiếtkế
“Hộp gen kháng nguyên VP2”
(Kozak-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid trung gian
(p∆L2.4-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid con thoi
(pShuttle-CMV-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pPacFAdV9-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pAd-Shuttle-VP2)
Tạoadenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L/R)
Tạo adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2

(CMV-Kozak-VP2-PolyA)
Thiếtkế
“Hộp gen kháng nguyên VP2”
(Kozak-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid trung gian
(p∆L2.4-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid con thoi
(pShuttle-CMV-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pPacFAdV9-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pAd-Shuttle-VP2)
Tạoadenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L/R)
Tạo adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(HAd5-VP2)
Sảnxuấtadenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L và R)
Sảnxuất adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(HAd5-VP2)
Công nghệ tế bào CEL
sảnxuấtvàkiểmtra

tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L/R)
Tạo adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(HAd5-VP2)
Sảnxuấtadenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L và R)
Sảnxuất adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(HAd5-VP2)
Công nghệ tế bào CEL
sảnxuấtvàkiểmtra
giống và vacxin
(FAd9-VP2-L và R)
Kiểm tra miễndịch của vacxin
FAd9-VP2-L và R
(Tiêu hóa; Hô hấp; Tiêm)
II
IIII
III
IV
V
VI
VII
VIII

5
i) Phân lập và lưu giữ gen đích kháng nguyên VP2: Cung cp ngun nguyên
liu gen VP2  thit k “hộp gen kháng nguyên VP2” t virus Gumboro ca

 cp CEL (chicken embryo

6
liver cell)  tip truyn to giống gốc/giống cấp 1 và sn xut vacxin; Ging
virus HAd5-VP2 c thc hin trên t bào HEK293  to và gi giống
nguyên gốc, nhng cng s dng dòng t bào này  sn xut virus làm vacxin.
vii) Các công nghệ tế bào sản xuất và kiểm tra giống và vacxin:  tài
KC04.24/06-10 ã thc hin công ngh chế tạo tế bào gan phôi gà s
 cp
(CEL)  sn xut và bc u kim tra kim nghim vacxin FAd9-VP2 (tên
gi: FADVAC) ca gia cm.
viii) Kiểm tra kiểm nghiệm vacxin thử nghiệm: Thc hin th nghim
min dch vi vi vacxin FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R a vào gà bng
ng tiêu hóa (ung), hô hp (nh mi) và tiêm (di da).
n khi kt thúc (tháng 12/2010),  tài KC04.24/06-10 ã hoàn thành mt
khi lng công vic (lit kê 
Hình 1.1), nh sau:
i) Đối với hệ thống FAd9 gia cầm: ã hoàn thành y  tt c các giai
on (bao gm i - viii), ã to c giống virus FAd9-VP2, ã xây dng c
các qui trình gm: a) Qui trình công ngh thit k và lp ghép gen kháng
nguyên c trng ca virus gây bnh Gumboro vào h thng vector adenovirus
nhc c (Qui trình thiết kế); b) Qui trình công ngh thu nhn adenovirus
nhc c tái t hp cha kháng nguyên làm công c d
n gen gây min dch
cho gia cm (Qui trình sản xuất); c) Qui trình a adenovirus cha gen kháng
nguyên VP2 vào ng vt thông qua ng tiêu hoá (ung/n), hô hp (khí
dung) và tiêm (Qui trình sử dụng); d) ng thi  tài ã sn xut c trên
5000 liều vacxin, ã kiểm tra kiểm nghiệm miễn dịch; và các sn phm hot
ng khác ca  tài và các ch tiêu liên quan khác (Hình 1.1).
ii) Đối với hệ thống HAd5 người:

công sức. Vacxin trên nền virus vector là loại virus sống nhược độ
c, dễ sản
xuất, khả năng sản sinh và giới thiệu kháng nguyên trong cơ thể đối tượng thích
ứng được coi là hoàn thiện. Hệ thống vector để làm vacxin đảm bảo tiêu chí qui
định là có khả năng cho phép sản xuất được một khối lượng lớn sử dụng công
nghệ tế bào, có hiệu giá cao, do vậy giá thành vacxin thấp, có hiệu quả kinh tế
(Bangari, Mittal, 2006)[15].
Adenovirus trong tự nhiên (loại hoang dã, wild type) là loại virus có kích
thước bé, hình thái đơn giản, có cấu trúc hình khố
i đối xứng, đường kính 80 -
110 nm, không có lớp vỏ ngoài cùng (envelop), capsid bao gồm 252 capsomer
phân chia thành 12 penton, 240 hexon và có 6 sợi protein (fiber) còn gọi là

9
angten (một số adenovirus loài chim có 12 angten). Capsid có cấu trúc 1 lớp,
trọng lượng phân tử khoảng 150 - 180 triệu Dalton (Da); cả hexon, penton và
angten đều là kháng nguyên bề mặt nổi, trong đó angten (fiber) mọc ra từ
penton có điểm mút (knob) làm vị trí tiếp xúc với thụ thể tế bào trong quá trình
gây nhiễm (Bunchen-Osmond, 2003; Benko et al., 2005) [17; 19] (Hình 2.1).
Adenovirus động vật bậc cao có hệ gen không phân đoạn, chứa một phân
tử DNA 2 sợi, kích thước 35.800 - 36.200 nucleotide (hệ gen adenovirus của
loài chim khoảng 42.000 - 43.000 nucleotide), mà tại hai đầu cuối của hệ gen
có b
ố trí hai chuỗi lặp ngược ITR (inverted terminal repetitions), mỗi chuỗi có
độ dài 103 bp đối với adenovirus của người, 50 - 200 bp đối với adenovirus
động vật khác, có vai trò quan trọng trong quá trình khép vòng hệ gen DNA
của virus. Hệ gen bao gồm 2 sợi: 1 sợi DNA hướng trái L (left), 1 sợi DNA
hướng phải R (right), chứa các tổ hợp gen sớm (E, early region) đó là các gen
E1A, E1B, E2A-B, E4; và một khung gen chung cho sao chép muộn (L, late
region), mã hoá cho 5 protein hợp nhất (L1 - 5) [3,4,36].

Protein giúp virus xuyên màng
(Penetration)
3 IIIa
Liên kết với Penton nền (Associated with
penton base)
Protein giúp virus xuyên màng
(Penetration) và Lắp ráp
(Assembly)
4 IV
Sợi angten (Fibre) và nút bám (knob)
Tiếp xúc thụ thể tế bào (Receptor
binding); Có khả năng liên kết
hồng cầu thực hiện ngưng kết hồng
cầu (Hemagglutination)
5 V
Protein đệm nhỏ liên kết với DNA và
Penton nền (Core: associated with DNA &
penton base)
Giống histon, bao gói DNA hệ gen
(Histone-like; packaging)
6 VI
Tiểu protein chèn màng liên kết Hexon
(Hexon minor polypeptide)
Ổn định cấu trúc/ Lắp ráp virus
(Stabilization/assembly of particle)
7 VII
Protein đệm lớn liên kết với DNA và
Penton nền (Core: associated with DNA &
penton base)
Giống histon, bao gói DNA hệ gen

virus (Genome packaging) 11
Hình 2.1. Hình thái và cấu tạo của adenovirus. A. Ảnh kính hiển vi điện tử mô
tả các hạt adenovirus có dạng hình khối sắp xếp với nhau tạo thành tập hợp. B.
Mô hình cấu trúc không gian của hạt virion adenovirus. Nguồn: Fields et al.,
Fundamental Virology (1996).


III
II
IV
IX
V
VI
VII
VIII
IIIa
X
Mu
TP
IVa2
A
knob
B
A
knobknobknob
B

12

Ống dẫn vào nhân

13
tổng hợp protein, tổng hợp DNA và bao gói virus đều xảy ra trong nhân tế bào
nhiễm.
Tất cả adenovirus đều có hệ gen là DNA hai sợi (double-stranded
DNA), đều thuộc họ Adenoviridae, hầu hết adenovirus đều vô hại, một số chỉ
gây nhiễm nhẹ trên các loài thích ứng mà không gây chết. Adenovirus được
phân làm 4 nhóm chính nằm trong họ Adenoviridae [19], đó là
Mastadenovirus, Aviadenovirus, Atadenovirus và Siadenovirus [17]. Phần lớn
adenovirus của động vật có vú đều thuộc về nhóm Mastadenovirus, kể cả các
serotype của adenovirus của ng
ười (human adenovirus, HAd). Tất cả mọi loại
adenovirus phân lập từ chim được phân loại thuộc về nhóm Aviadenovirus.
Nhóm Atadenovirus bao gồm những virus đơn nhất, phân lập từ cừu, bò, hươu,
thú có túi và một vài loài chim. Nhóm thứ tư mới được phân loại gần đây là
Siadenovirus được tạm quy định bao gồm tất cả các adenovirus phân lập từ
ếch, cá, một số loài không xương sống và loại virus gây bệnh viêm ruột xuất
huyết ở
gà tây [17,25].
Adenovirus tái tổ hợp làm vacxin có khả năng sản sinh đáp ứng miễn
dịch dịch thể, miễn dịch trung gian tế bào và thích ứng hấp phụ lên tế bào niêm
mạc hệ hô hấp và hệ tiêu hóa để sản sinh miễn dịch niêm mạc [14]. Adenovirus
đã được làm vector vacxin đối với nhiều bệnh ở người và gia súc, gia cầm,
trước hết phải kể đến dịch hạch Yersinia pestis, nhiệt thán Bacillus anthracis, vi
khuẩn lao, số
t xuất huyết Dengue, sốt xuất huyết Ebola, sốt xuất huyết Dengue
đa type, hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải HIV/AIDS ở người và khỉ, hội
chứng hô hấp virus cấp ở người SARS, cũng như nhiều tác nhân gây bệnh khác
ở người. Đối với động vật, nhiều loại vacxin trên nền adenovirus đã được

- Vacxin HAd5 vector đối với virus Ebola kích thích sinh miễn dịch bảo hộ
tốt khi công cường độc bằng virus Ebola và loài động vật thí nghiệm gần người
(primates).
- Vacxin HAd5 vector đối với virus HIV-1 chứa gen kháng nguyên env có
khả năng kích thích miễn dịch bảo hộ ch
ống lại virus HIV khi thử nghiệm trên
khỉ rhesus và khỉ baboon.
- Vacxin HAd5 vector mang gen kháng nguyên của vi khuẩn nhiệt thán
(Bacillus anthracis) cho khả năng bảo hộ hiệu quả đối với vi khuẩn nhiệt thán
cường độc phòng bệnh tahn ở người và động vật.

15
- Vacxin HAd5 vector mang gen virus hội chứng hô hấp cấp tính (SARS)
thuộc loại Coronavirus cho đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tốt khi thử nghiệm trên
chuột BALB/c và khỉ Rhesus macaque (Macaca mulatta).
- Vacxin HAd5 vector đối với virus cúm A/H5N1 mang gen H5 đã cho miễn
dịch và bảo hộ tốt trên gà và chuột/chồn Ferret khi công cường độc bằng chủng
A/Vietnam/1203(04)(H5N1).
- Hệ thống HAd5 vector cũng có thể còn được sử dụng như là một công cụ
liệu pháp miễn dịch, ch
ống ung thư, điều trị bệnh ty thể, sản xuất kháng thể đơn
chuỗi scFv (single chain fragment variable) và biểu hiện kháng thể đơn chuỗi
trong tế bào cơ thể, định hướng phá bỏ gen thông qua cơ chế can thiệp của
RNAi.
Đối với adenovirus loài chim (FAd, Fowl adenovirus):
- Nuôi ở mật độ đông, gia cầm cần có nhiều loại vacxin sử dụng thuận lợi
qua đường tiếu hóa, hô hấp, nên một loạt các type adenovirus loài chim, FAd1,
FAd8, FAd9 và FAd10 là các h
ệ thống được nghiên cứu nhiều nhất làm vacxin
ở gia cầm.