RT: 0.00 - 10.00 SM: 5B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min)
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
0
20
40
60
80
100
Relative Abundance
RT: 5.18
MA: 488579
SN: 812
5.74
7.296.60
8.22 9.318.65
RT: 5.18
MA: 1197952
SN: 6318
RMS
5.88
4.68
7.46 8.72 9.486.64 8.22
NL:

60
80
100
Relative Abundance
RT: 3.76
MA: 344845
SN: 8227
RMS
4.27
1.010.73 3.212.131.32 2.66
RT: 3.75
MA: 1298932
SN: 197
3.281.36 1.88 2.780.38
NL:
3.50E4
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[261.500-
262.500] MS
KS5-3
NL:
1.35E5
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[290.500-

4.87
9.47
8.71
6.39
7.06 8.05
NL:
4.74E4
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[165.500-
166.500] MS
KS5-3
NL:
4.18E4
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[191.500-
192.500] MS
KS5-3
RT: 0.00 - 10.00 SM: 5B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min)
0
20
40
60

0
[103.500-
104.500] MS
KS5-3
NL:
9.32E3
TIC F: + c APCI
SRM ms2

0
[133.500-
134.500] MS
KS5-3
MỤC LỤC
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 1
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC
CHẤT CHUYỂN HOÁ THUỘC NHÓM
NITROFURAN TRONG THỦY SẢN
I. NITROFURAN
An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang được cả xã hội quan tâm, đặc biệt là ở
đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát hiện
trong thực phẩm khiến dư luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh doanh
nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề đáng lo
ngại, như việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử dụng các
chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dư các hóa chất, kháng
sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu
dùng.
Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thường được sử dụng trong thức ăn
gia súc như kích thích tăng trưởng và là phương pháp điều trị dự phòng, điều trị các
bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong chăn

dương. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác dụng
tốt trong việc giệt trừ giun đũa.
Với nồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác dụng diệt
khuẩn.
Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong việc diệt khuẩn
salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dưỡng.
Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho gà và lợn còn tăng trọng
nhanh.
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 3
Nitrofuran ảnh hưởng đến sức khỏe con người như gây ung thư và đột biến, khi
thực phẩm có tồn dư nitrofuran và các dẫn xuất của nó.
Do đó hầu hết các nước trên thế giới đã cấm sử dụng kháng sinh nhóm nitrofuran
trong chăn nuôi. Ở Việt Nam, bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định
cấm sử dụng nitrofuran cho vào trong thức ăn chăn nuôi. EU đã quy định yêu cầu
giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa
nhóm nitrofuran là 1 μg/kg.
2. Dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm
Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thường xuyên được phát hiện thấy trong thịt gia
cầm và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nhập khẩu vào các nước EU từ Thái Lan,
Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil.
Hơn nữa, dư lượng nitrofuran cũng được tìm thấy trong sản phẩm gia súc và gia
cầm ở Châu Âu như: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari. Sau đó EU đã
kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn 9
quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc (37%),
Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm tôm, mật
ong và thịt hộp.
Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập khẩu từ
Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê, cá ba
sa cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran trong tôm.
Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS. Nguyễn Quốc Ân, phó trưởng phòng

- Cột bảo vệ pha đảo C18 (Symmetry Sentry Guard hoặc tương đương), kích thước
20 x 3,9mm;
- Cột C18 (Symmetry hoặc tương đương) kích thước150 x 3,0 mm, 5 µm. [Cột sắc ký
Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5μm)].
- Ðầu dò khối phổ dạng bốn cực với giao diện ESI (Triple quadrupole Micromass
Quattro Ultima hoặc tương đương).
- Cột chiết pha rắn SPE (Oasis HLB).
- Máy lắc vortex VELP.
- Máy đồng nhất mẫu.
- Máy li tâm MIKRO 22R.
- Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg).
- Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g).
- Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt.
- Bể điều nhiệt
4.2 Dụng cụ
Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml.
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 6
- Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml.
- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 μl; 1000 μl; 5 ml…đầu côn.
- Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 μm.
- Vial loại 1,8 ml.
- Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml.
- Ống nghiệm thủy tinh…
5. Hóa chất, dung dịch
5.1 Hóa chất
- Methanol (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)
- Amoni acetate (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 98%)
- 2-NBA (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%)
- K2HPO4.3H2O (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%)
- NaOH (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)

Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH D-30918 Seelze
- Nitrofurantoin VETRANAL, 99,9%
Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH D-30918 Seelze
CAS-No: [67-20-9]
5.2.2 Pha chế chất chuẩn
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 8
- Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và
định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng
được trong 6 tháng.
- Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 μl chuẩn AHD 1000 mg/l định mức bằng
methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6
tháng.
- - Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và
định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.
- - Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 μl chuẩn SEM 1000 mg/l định mức bằng
methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6
tháng.
- - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lượt 1 ml
chuẩn AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức
bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được
trong 3 tháng.
- - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 μg/l: hút 200 μl hỗn
hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào
bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 1 tháng.
- - d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol
vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6 tháng.
- - d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 μl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào
bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6 tháng.
- - d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d5-AMOZ định mức bằng
methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 6

6.3 Thuỷ phân và dẫn xuất hoá
Thêm 10 mL hydrochloric acid 0,125 M và 400 mL dung dịch 2-NBA trong
DMSO vào các ống nghiệm chứa mẫu. Đậy nắp ống và vortex khoảng 1 phút. U
mẫu qua đêm (từ 14 đến 16 giờ) ở nhiệt độ 37 ± 2
o
C.
6.4 Trung hoà
Sau khi làm nguội, thêm 1 mL dung dịch K
2
HPO
4
0, 1M. Lắc đều. Điều chỉnh
pH về (7,2÷7,4) bằng NaOH 1 M (kiểm tra bằng máy đo pH). Lắc và để yên trong
5 phút. Kiểm tra lại pH và điều chỉnh thêm nếu cần thiết. Ly tâm mẫu trong 10
phút ở tốc độ 5000 vòng/phút, lấy phần trong (dung dịch A).
6.5 Chiết
- Chuẩn bị cột SPE : Nối cột vào bộ chiết SPE, thêm lần lượt 3 mL ethyl acetate, 3
mL methanol và 5 mL nước cất vào cột. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột.
- Làm sạch dịch chiết: Cho dung dịch A vào cột đã được chuẩn bị.
- Rửa cột: Khi mẫu vừa qua hết, thêm 5 mL nước vào cột. Loại bỏ dịch chảy ra
khỏi cột. Sau đó, cột được làm khô bằng hút chân không khoảng 20 phút.
- Giải hấp: bằng cách cho 2 x 2 mL ethyl acetate chảy qua cột với tốc độ 1.5
mL/phút. Dung dịch chảy ra khỏi cột được thu vào ống nghiệm 10 mL và thổi khô
bằng dòng khí nitơ.
6.6 Chuẩn bị mẫu phân tích
Hòa tan cặn khô bằng chính xác 1 mL dung dịch pha động, vortex 20 giây. Lọc
dịch đục qua màng lọc 13 mm, 0.45µm và thu dịch lọc vào lọ vial cho HPLC.
7. Phân tích trên LC /MS/MS
7.1 Điều kiện máy LC
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 11

- Sheath gas pressure: 30
- Ion sweep gas pressure: 1,0
- Aux gas pressure: 5
- Capillary temperature: 250
- Capillary offset: 35
- Q2 gas pressure: 1,5
7.3 Điều kiện phân ly MS/MS:
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 12
Các tiền ion thuộc nhóm Nitrofuran bị phân ly thành các ion con liên quan đến
cấu trúc:
Chất phân
tích
Chất đo đạc Ion bị
phân
mảnh, m/z
Ion được
tạo thành,
m/z
Q1, Q3
PW, amu
Tube lens
Furazolidone
hay AOZ
2_NB_AOZ 236 134 (11)
104 (22)
0,7 95
Furaltadon
hay AMOZ
2_NB_AMOZ 335 291 (11)
262 (17)

m
C
X
Nitrofuran
1
0
×
=
Hàm lượng các metabolite tương ứng:
1
2
M
M
XX
NitrofuranMetabolite
×=
Trong đó: - X: lượng chất cần phân tích có trong mẫu kiểm, µg/kg
- C
o
: nồng độ chất cần phân tích tính từ đường chuẩn, µg/L
- 1: Thể tích định mức 1 mL, mL
- m: khối lượng mẫu phân tích, g
- M
1
: phân tử khối của nitrofuran
- M
2
: phân tử khối của metabolite tương ứng
Bảng 1. Ion định lương và ion xác nhận của các chất họ nitrofuran
Chất cần phân tích Chất đo đạc

1. Các thông số cần đánh giá:
Mục này được thực hiện nhằm đánh giá độ độ lặp lại của thiết bị, vùng tuyến tính,
hiệu suất thu hồi và giới hạn phát hiện của phương pháp - được thực hiện lần đầu tiên
bởi người phát triển phương pháp. Trong quá trình kiểm nghiệm, phân tích, người có
nhiệm vụ phân tích không phải thực hiện mục này
1.1 Yêu cầu:
- Hiệu suất thu hồi trên các nền mẫu khác nhau phải thỏa điều kiện sau (theo
2002/657/EC)
Khoảng nồng độ Hiệu suất thu hồi,
%
≤ 1 ppb
50 – 120
> 1 ppb đến 10 ppb 70 – 110
≥ 10 ppb
80 – 110
- Độ lệch chuẩn (RSD) tương ứng của 03 lần thực hiện riêng biệt trên cùng một
nồng độ phải nhỏ hơn 10%.
1.2 Đánh giá khoảng tuyến tính:
Do đặc tính của đầu dò khối phố 3 tứ cực (cho độ nhạy cao) và hàm lượng
nitrofuran trên nền mẫu thực tế (có hàm lượng thấp, mức ppb) nên phần đánh giá
khoảng tuyến tính chỉ khảo sát với khoảng nồng độ ≤ 5 µg/L. Với các mẫu có
nồng độ C
o
(nồng độ cuối khi tiêm vào máy) vượt quá 5 µg/L, cần giảm lượng
mẫu cân hoặc pha loãng mẫu trước khi tiến hành phân tích.
Đường chuẩn xây dựng dựa trên mẫu kiểm soát phải có độ tuyến tính tốt, hệ số
tương quan hồi qui tuyến tính (R
2
) phải lớn hơn hoặc bằng 0.99.
1.3 Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp:

4.1. So sánh quá trình dẫn xuất hóa của nitrofuran và metabolite với 2-NB
a. Furazolidone
Bảng 1. Đường chuẩn Furazolidone
C
oFurazolidone
, µg/L
Diện tích mũi sắc
ký (Area)
0,477 93654
0,795 152725
1,59 329523
3,18 650242
6,36 1295423
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 18
b. AOZ
Bảng 2. Đường chuẩn AOZ và so sánh
C
oAOZ
µg/L
C
oFur tđương
µg/L
Diện
tích
(Area)
C
oFur theo Bảng 1
µg/L
Sai lệch
µg/L

, Co
AOZ
Diện tích Area
TB
RSD
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 19
ppb
µg/L µg/L
(m/z
134)
%
Blank 0 0 0 0 0 -
KS
1_1
0,2385 0,477 0,218
89535
86909 2,9KS
1_2
86642
KS
1_3
84548
KS
2_1
0,3975 0,795 0,363
146927
145465 1,0KS
2_2
145473
KS

1200645
KS
5_3
1197952
Mw
FURAZOLIDONE
= 225,16
Mw
AOZ
= 102,9 (g/mol)
(*)
Nồng độ tính trên lượng mẫu cân là 2 g

Bảng 4, Đường chuẩn
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 20
AOZ
C
oAOZ
,
µg/L
Diện
tích
TB
0,218 86909
0,363 145465
0,727 284936
1,453 632584
2,907 1198506
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 21
[103.999-

%
Blank 0 0 0 0 0 -
KS
1_1
0,2735 0,547 0,339
81386
85564 8,1KS
1_2
93539
KS
1_3
81767
KS
2_1
0,547 1,094 0,679
186471
190415 3,5KS
2_2
186747
KS
2_3
198027
KS
3_1
0,8205 1,641 1,018
285874
295442 3,4KS
3_2
294576
KS

Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 23
Bảng 6, Đường chuẩn AMOZ
Co
AMOZ
, µg/L
Area
TB
0,339 85564
0,679 190115
1,018 295442
1,697 572464
3,394 1297477
[261.900-
261.902]
[290.079-
291.081]
MA: 50212
MA: 186471
KS2-1
KS2-1
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 24
c. Nitrofurazone
Bảng 7, Độ lặp lại của phương pháp
Mẫu
C
NITROFURAZONE_mẫu
(*
)
ppb
Co

KS
2_3
116799
KS
3_1
0,5 1 0,379
215781
219431 1,8KS
3_2
218923
KS
3_3
223588
KS
4_1
0,75 1,5 0,568 309950 0,9
Các phương pháp xác định dư lượng hợp chất họ nitrofuran trong thủy sản 25