Đồ án chuyên môn GVHD:
MỞ ĐẦU 4
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 5
1.1. Tình hình nghiên cứu 5
1.2. Cấu tạo hoá học 6
1.2.1. Phân loại 7
1.4. Cơ chế tác dụng ([5]) 8
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tốc độ đến phản ứng ([5]) 9
1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ ([E]) 9
1.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 10
1.5.3. Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm 11
1.5.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa 13
1.5.5. Ảnh hưởng cuả nhiệt độ 13
1.5.6. Ảnh hưởng của pH 13
1.6. Nguồn thu nhận ([4]) 14
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 16
2.1. Tình hình nghiên cứu 16
2.2. Cấu tạo 16
2.3. Cơ chế tác dụng 18
2.4. Nguồn thu nhận 18
3.1. Đặc điểm cấu tạo([3]) 19
3.2. Vai trò của giống ([3]) 20
3.3. Yêu cầu của giống ([3]) 20
3.4. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [9] 21
3.4.1. Nuôi cấy bề mặt 21
3.4.2. Nuôi cấy chìm 21
3.5. Nguyên liệu sản xuất 22
3.6. Phương pháp phân lập 23
3.6.1. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên 23
3.6.2 . Phân lập giống trong điều kiện sản xuất 23
3.6.3. Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng 24

5.6.1. Hải sản 39
5.6.2. Nước 39
5.6.3. Muối 39
5.6.4. Nấm mốc Asp.oryzae 39
5.7. Một số nguyên nhân dẫn đến nước mắm kém chất lường và cách phòng chữa 40
SVTH: Trang 2
Đồ án chuyên môn GVHD:
5.7.1. Chượp chua 40
5.7.2. Chượp đen 41
5.7.3. Chượp thối 41
5.7.4. Nước mắm thối 42
5.8. Bảo quản 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NHỊ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44
SVTH: Trang 3
Đồ án chuyên môn GVHD:
MỞ ĐẦU
Một trong những thành tựu to lớn của khoa học công nghệ trong thơi gian gần đây là
nghiên cứu về enzyme, nó đặt trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấy
chục năm qua, đó là những khám phá về cấu trúc hóa học và các cơ chế tác dụng kỳ diệu
của enzyme- xúc tác sinh học. Enzyme đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong nghành công
nghiệp hiện đại.
Trước đây enzyme enzyme được dùng trong nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất
thường được thu nhận từ động vật, thực vật. Trong những năm gần đây người ta bắt đầu
chú ý đến một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền. Đó là nguồn enzyme được
tách chiết từ vi sinh vật. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển nhanh do đó có thể tạo ra một
lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme này có hoạt lực
xúc tác rất cao. Do đó, chúng được ứng dụng cho nền sản xuất enzyme.
Qua nhiều năm việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease
đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá

xưa đã biết dùng vi sinh vật như là nguồn enzyme trong các quá trình lên men như sản
xuất bánh mì, sản xuất giấm, rượu vang….
Thế kỉ XVII đến nửa đầu thế kỉ XVIII đã đề ra được khái niệm lên men Vanhemom
người Hà Lan lần đầu tiên quan sát được hiện tượng tạo thành chất khí khác không khí
trong quá trình lên men.
SVTH: Trang 5
Đồ án chuyên môn GVHD:
Năm 1659, Silvius lần đầu tiên nêu lên rằng, về cơ bản, tất cả các quá trình sống đều
là những quá trình hóc học.
Nửa cuối thế kỉ XVIII đã có thí nghiệm đầu tiên về enzyme chẳng hạn như công
trình nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày. Công trình này do Reaumur (người
Pháp) bắt đầu và sau đó được Sapallanzani (người Ý) mở rộng. Các tác giả đã cho thịt vào
ống kim loại và đưa vào trong nhiều động vật khác nhau và thấy rằng thịt bị tiêu hoá.
Năm 1836, Schwann đã gọi chất tiêu hoá thịt này là pepsin (pepxin).
Từ năm 1800 người ta còn thấy rằng trong ruột còn có một enzyme phân giải protein
khác. Sau đó Kuhne đặt tên enzyme đó là trypsin.
Nửa đầu thế kỉ XIX người ta đá tách được một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên
liệu khác nhau có tách dụng thuỷ phân các chất tương ứng và bắt đầu tách được các chất
tạo nên quá trình lên men.
Nửa cuối thế kỷ XIX đã tinh sạch được một số enzyme và nghiên cứu một số tính
chất cơ bản của enzyme.
Nửa đầu thế kỉ XX đã phát hiện được CoE (Harden và Young, 1906) xác định ảnh
hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme (Sorensen, 1909) nghiên cứu động học phản ứng
enzyme (Bayliss, 1919) kết tinh được enzyme và xác định được bản chất hoá học của
enzyme là protein….Đã áp dụng thành công các phương pháp hiện đại để nghiên cứu
enzyme hoàn thiện phương pháp xác định cấu trúc bậc 1 phân tử enzyme.
1.2. Cấu tạo hoá học
Các enzyme là những protein được cấu tạo từ 20L – amino acid (Các amino acid
kết hợp với nhau qua liên kết peptid (-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa
nhóm α - carboxyl của amino acid đứng trước, với nhóm amoha-amin của amino acid

6. Ligase (synthetase): các enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp có sử dụng
liên kết giàu năng lượng của ATP…
Mỗi lớp chia thành nhiều tổ (dưới lớp), mỗi tổ chia thành nhiều nhóm (siêu lớp).
Tên enzyme thường được gọi: Tên cơ chất đặc hiệu - loại phản ứng xúc tác cộng
thêm tiếp vĩ ngữ ase.
SVTH: Trang 7
Đồ án chuyên môn GVHD:
1.3. Tính chất
Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số
enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn.
Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các
dung môi không phân cực.
Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính. Môi
trường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động.
Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation,
anion hay trung hòa điện.
Enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin,
amylase và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein)
1.4. Cơ chế tác dụng ([5])
Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian
enzyme cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa, biến đổi tạo thành sản phẩm.
Nhiều dẫn liệu thực nghiệm đã cho thấy quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ
chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải
qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau.
E + S → ES → P + E
Hình 1.1. Cơ chế tác dụngcủa enzyme
SVTH: Trang 8
Đồ án chuyên môn GVHD:
Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là
sản phẩm (Product)

. Do đó nên tiến
hành lựa chọn nồng độ enzyme trước khi xác định hoạt độ enzyme hoặc nghiên cứu động
học phản ứng enzyme
1.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Tốc độ của các phản ứng đơn giản trong ở phương trình hóa học biểu diễn theo
phương trình động học Michaelis – Menten.Ở trạng thái đầu, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Nếu tại điểm đó,
tất cả các phân tử enzyme đã thực hiện chức năng xúc tác của mình thì nó được gọi là tốc
độ phản ứng tối đa với một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong
dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng dần nhưng đến một lúc nào đó thì sự
gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính của Enzyme. Đó là vì tất cả
các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hoà bởi cơ chất.
SVTH: Trang 10
[E]
1
[E]
2
[E]
3
Đồ án chuyên môn GVHD:
1.5.3. Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm
Các chất kiềm hãm (I), cũng gọi là chất ức chế, là những chất làm giảm tốc độ phản
ứng do enzyme xúc tác.
Cách 1: Kìm hãm cạnh tranh
Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh là cơ chất và chất kìm hãm đều tác dụng lên
trung tâm hoạt động của enzyme, chất kìm hãm choán chỗ của cơ chất ở enzyme.
Hình 1.4. Kiểu kìm hãm cạnh tranh
Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất

Là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông
thường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu cơ như các vitamin tan trong
nước như Mg
2+
hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như
pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosinetriphosphatase (cơ chất là ATP).
Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào
nồng độ.
1.5.5. Ảnh hưởng cuả nhiệt độ
Có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trừơng,
hiện tượng này tuân theo quy luật Vant’- Hoff. Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên
10
0C
thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 2 lần.
Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng
chỉ trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzyme là protein. Khi ta tăng nhiệt độ lên
trên 40-50
0C
xảy ra quá trình phá huỷ chất xúc tác. Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng do
enzyme xúc tác sẽ giảm. Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinh
với các phản ứng vô cơ thông thường.
Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp
enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-60
0C
, cũng có enzyme có nhiệt độ tối ưu rất
cao như các enzyme của những chủng ưa nhiệt. Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đặc biệt
các vi khuẩn chịu nhiệt có chứa enzyme chịu nhiệt cao.
1.5.6. Ảnh hưởng của pH
Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay
đổi tính chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất hoạt động của phân tử

là động vật còn non để tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, sản xuất các loại chế phẩm để
chuyển hóa phế thải nông nghiệp cải tạo đất.
SVTH: Trang 14
Đồ án chuyên môn GVHD:
1.7.3. Trong y học
Dùng trong chuẩn đoán bệnh, điều trị bệnh…
SVTH: Trang 15
Đồ án chuyên môn GVHD:
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE
2.1. Tình hình nghiên cứu
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà
khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở
nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Enzyme là chất xúc tác sinh học không
chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất
quan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công
nghệ gen và bảo vệ môi trường. Trong những năm gần đây giá trị của enzyme công
nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD trong đó chủ yếu là các enzyme thuỷ phân
(75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp
(59%)
2.2. Cấu tạo
Nhóm enzyme protease (peptitd – hidrolase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết
peptitd (-CO-NH-) trong phân tử protein, từ poly peptitd đến sản phẩm cuối cùng là acid
amind. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển
acid amin.
Hình 2.1. Cấu trúc không gian của protease
SVTH: Trang 16
Đồ án chuyên môn GVHD:
Protease được phân thành 2 loại: endopeptitlase và exopeptidase. ([7])
Dựa vào vị trí tác động trên mạch poly peptid, exopeptidase được phân thành 2 loại:
Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi poly

2.4. Nguồn thu nhận
Hiện chúng ta sử dụng 3 nguồn sinh học cơ bản để thu nhận protease chẳng hạn như
các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật…
Động vật: Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc dạ dày
niêm mạc ruột non, tuyến tụy)…. Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậc
cao, Chymosin “ rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi.
Thực vật: Papain từ mủ thu đủ xanh, Bromelin từ thân cây dứa, Ficin tách từ dịch ép
thân cây sung
Vi sinh vật: phân bố chủ yếu ở nấm mốc vi khuẩn và xạ khuẩn…gồm các loại thuộc
Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium…
SVTH: Trang 18
Đồ án chuyên môn GVHD:
CHƯƠNG 3 TỔNG QUAN VỀ ASPERGILLUS OZYZAE
3.1. Đặc điểm cấu tạo([3])
Aspergillus gồm hơn 185 loài khoảng 20 loài cho đến đã được báo cáo là tác nhân
gây bệnh nhiễm trùng cơ dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme . Trong số
này, Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus, Aspergillus
niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus, versicolor,
Aspergillus oryzae… -
Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase,
protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin.
Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương
theo phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này để
sản xuất tương.
Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty có
nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh
lợt có ít vàng.
Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi sang
màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia.
Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae.

SVTH: Trang 20
Đồ án chuyên môn GVHD:
Để tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên men
công nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.
3.4. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [9]
3.4.1. Nuôi cấy bề mặt
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát
triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt
chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lòng môi trường đã được
tiệt trùng, làm ẩm. Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… Có chất phụ gia
là trấu. Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những
chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các chất phụ gia phải đảm
bảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể
bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
10, phospho, nitơ hữu cơ và các chất
kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Với phương pháp này
nồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi
sinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế
phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần
khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có
thể thực hiện quy mô gia đình. Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá

S, Fe, K và các chất vi lượng khác như.
3.5.1. Nguồn cacbon ([8])
Đối với Asp.oryzae: frucfoza saccroza maltoza glucoza manit
arabinoza glactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease.
Chảng hạn như: vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường
tinh bột lớn hơn 8%.
Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và sinh
tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 – 1,5%
sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme.
SVTH: Trang 22
Đồ án chuyên môn GVHD:
3.5.2. Nguồn nitơ ([2]), ([8])
Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH
4,
H
2
PO
4
là tốt hơn cả. Các nguyên liệu đã
chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép
quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi
lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa sinh tổng hợp
enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.
3.6. Phương pháp phân lập
Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật. Ở những
nơi giàu chất hữu cơ, trong không khí, trong cơ thể động vật, thực vật….Chính vì vậy mà
vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất.
Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

, 10
-4
.
Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào môi trường PDA
Dùng que trang trang đều mãu trên bề mặt thạch
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên sẽ xuất hiện những quầng sáng
quanh khuẩn lạc
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy.
Cấy chuyền những mớc đặc trưng vào trong môi trường Pda trong ống thạch
nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h.
Nhân giống vi sinh vật trong bình tam giác: cho10ml nước cất vo trùng vào ống
thạch nghiêng có chứa bào tử. Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường
Hút 0,1ml dung dịch cho vào bình tam giác chứa môi trường sinh trưởng của nấm
KH
2
PO
4
1,4g MgSo
4
0,1g
NH
4
NO
3
10g FeSo
4
0,01g
KCL 0,5 Hồ tinh bột 20g pH=6,5
Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc mang đi bảo quản, dự trữ.
Để có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp bảo quản thích hợp.

Trích đoạn Chượp chua

---