Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển trong đời sống vật chất, đời sống tinh thần và
nhu cầu thưởng thức cái đẹp của con người cũng không ngừng tăng lên.
Trong cuộc sống, hoa là một trong những vẻ đẹp đến từ thiên nhiên mà con
người dễ dàng thưởng thức nhất, luôn là tâm điểm của mọi sự chú ý, nhất là
vào những dịp lễ Tết và các hoạt động văn hoá. Ngày nay, việc trồng hoa
không chỉ mang ý nghĩa xã hội mà còn mang ý nghĩa lớn về mặt kinh tế, nhất
là xuất khẩu. Vì vậy ngành sản xuất hoa đã và đang đóng vai trò quan trọng
trong các ngành sản xuất nông nghiệp nói riêng và trong nền kinh tế nói
chung. Hoa mang lại lợi nhuận lớn cho những người tham gia sản xuất và
kinh doanh. Hoa góp phần mang lại vẻ đẹp cho cảnh quan, hệ sinh thái và môi
trường sống của con người.
Trong vườn hoa muôn màu muôn vẻ của thế giới tự nhiên, có lẽ hiếm
có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp trong mình nhiều họ, nhiều chủng loại,
màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ, mê hoặc con người một cách kỳ lạ
cho bằng hoa Lan. Hoa Lan không chỉ mang vẻ đẹp đài các, sang trọng nhưng
ấm áp, gần gũi mà nó còn chất chứa trong mình những giá trị tiềm ẩn, luôn
mới lạ, luôn hấp dẫn và mời gọi lòng say mê, khám phá của những ai trót
nặng lòng với loài hoa vương giả này. Trong số những loài hoa Lan được nuôi
trồng chủ yếu ở nước ta, bên cạnh những loại hoa tương đối dễ chăm sóc như
Mokara, Dendro, Lan vũ nữ… thì vẫn có những loài hoa Lan chỉ thích hợp
với một số khu vực địa lý nhất định mà cụ thể nhất là địa Lan, loài hoa chỉ có
thể nuôi trồng trong điều kiện lí tưởng của Đà Lạt… Không quá kén chọn và
hạn chế nơi trồng như địa Lan song Lan Hồ điệp cũng là một trong những
giống Lan quý mà qui trình chăm sóc, thuần dưỡng cũng đòi hỏi lắm công
phu, tâm huyết của người trồng.
2.1. Giá trị kinh tế của hoa Lan
2.1.1. Trên thế giới
Hoa Lan là một loài hoa rất đa dạng về kích thước, hình dáng, màu sắc,
cấu trúc, số lượng và hương thơm. Trong số các loại hoa thương phẩm lớn
hiện nay, hoa Lan là một loài có triển vọng kinh tế hết sức cao. Ngay từ năm
1957, James Shoemaker đã cho rằng “Nuôi trồng Lan sẽ không chỉ là một sở
thích mà còn hướng tới trở thành một ngành công nghiệp”. Và quả vậy, ngành
trồng Lan đang ngày càng phát triển mạnh mẽ.
Từ thời xưa cho đến nay, hoa Lan luôn được con người ngưỡng mộ và
được xem như là nữ hoàng của các loài hoa, loài hoa vương giả hay vua của
những loài cỏ cây có hoa. Do có vẻ đẹp rực rỡ, quý phái, ngào ngạt hương
thơm, thanh nhã cao sang và trước đây hoa Lan được xem là loài quý hiếm,
nên thời gian trước thú chơi hoa Lan thường chỉ dành cho giới vua chúa,
thượng lưu. Ngày nay, thú chơi hoa Lan đã được nâng lên thành nghệ thuật,
nghề trồng Lan đã được phát triển thành ngành công nghiệp có lợi nhuận cao
ở một số nước như Thái Lan, Đài Loan,… Hơn nữa, nhờ quá trình sưu tầm
các loài hoa Lan đẹp, lạ mắt và các kỹ thuật lai tạo ra các hoa Lan mới tuyệt
đẹp, nên số loài hoa Lan hiện nay trên thế giới có thể đã lên đến 100000 loài.
Vì thế trong thời gian gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam ta, thú chơi
hoa Lan đã trở thành thông dụng và có điều kiện hơn, không phân biệt địa vị,
tuổi tác, hoàn cảnh kinh tế nữa, số người chơi và yêu chuộng hoa Lan ngày
càng tăng nhanh, hay nói cách khác nhu cầu sử dụng các chủng loại hoa Lan
đã và đang tăng. Hoa Lan hiện đang được trồng và kinh doanh với 03 kiểu
dáng phổ biến trên thị trường: hoa cắt cành, cây đã thành thục trong chậu treo
hay bám trên giá thể và cây Lan con từ 10-15cm
(
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 4
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 5
khác như Sa Pa, Phú Yên bước đầu đã khảo sát và nghiên cứu phương pháp
nhân giống, hoàn thiện quy trình sản xuất hoa Lan.
Theo tính toán của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, nếu trồng
hoa Lan cắt cành là loài Dendrobium và Mokara, mỗi ha đất trồng có thể cho
thu nhập 500 triệu đến 1 tỷ đồng/năm, cao hơn nhiều lần so với trồng lúa và
một số hoa màu khác. Hiện nay, mỗi năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ
đồng để nhập hoa Lan từ các nước láng giềng cho nhu cầu nội địa. Chỉ tính
riêng tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2003 doanh số kinh doanh hoa Lan và
cây cảnh mới đạt 200 - 300 tỷ đồng, nhưng chỉ trong quý I năm 2006, doanh
số này đã đạt 400 tỷ đồng; các cơ sở kinh doanh hoa Lan, cây cảnh tăng
nhanh từ 264 cơ sở năm 2003 lên trên 1.000 cơ sở. Riêng hoa Lan mỗi năm ở
thành phố này lượng tiêu thụ cũng đã lên đến hàng triệu cây
(
2.1.3. Tầm quan trọng đối với việc duy trì và bảo vệ nguồn giống
Khí hậu ở Việt Nam nóng ẩm rất phù hợp với sự sinh trưởng và phát
triển của các loài lan. Theo giáo sư Phạm Hoàng Hộ, hoa Lan Việt Nam rất đa
dạng và phong phú với số lượng lên tới 755 loài (Phạm Hoàng Hộ, 2000).
Theo nguồn tài liệu ngiên cứu mới nhất về hoa Lan ở Việt Nam năm 2003, đã
biết được 897 loài thuộc 152 chi của họ Lan (Trần Duy Quý, 2005).
Hoa Lan là một loại cây cảnh rất được ưa chuộng trên thị trường. Tuy
nhiên, do các mục đích kinh tế, con người đã không quan tâm tới sự bảo tồn
thiên nhiên nói chung cũng như bảo vệ các nguồn giống quý nói riêng. Lan
được khai thác từ rừng và vận chuyển tới các thành phố lớn trong nước và
nước ngoài, đặc biết những giống đặc hữu và quý hiếm. Nguồn tài nguyên
này đang ngày càng cạn kiệt () mà không có cách gì
2.2.2.1. Tên và nguồn gốc
Lan Hồ Điệp có tên khoa học là Phalaenopsis là loài có hoa lớn, bền,
đẹp. Có tên từ chữ grec Phalaina nghĩa là bướm và opsis có nghĩa là sự giống
nhau. Lan Hồ Điệp là loài Lan có hoa giống bươm bướm phất phơ rất đẹp.
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 7
Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius
đặt tên là Angraecum album. Năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum.
Năm 1825 nhà thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis. Chi Phalaenopsis
Họ Orchidendrodeae
Bộ Asparagales
Lớp Liliopsida
Ngành Magnoliophyta
Giới Thực vật
Hình 2.1. Phalaenopsis amabilis
Lan Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở: Malaysia, Indonexia, Philipin, phía
đông Ấn Độ và Úc. Ở Việt nam cũng có một số loài vì có hoa nhỏ nên được
gọi là tiểu Hồ Điệp (phalaenopsis manni, gibbosa, lobbi, fuscata, cornucervi).
Lan Hồ Điệp có thể mọc ở khí hậu nhiệt đới và đồi núi cao 2000m nên vừa
chịu được khí nóng ẩm vừa chịu được khí hậu mát.
Lan Hồ Điệp có chừng 44 loại nguyên giống, cây có thể mọc ở xứ nhiệt
đới và đồi núi cao 2000 mét nên vừa chịu khí hậu nóng ẩm lại vừa chịu khí
Hình 2.2. Một số loài Lan Hồ Điệp
Cách trồng
- Nhiệt độ: Lan Hồ Điệp là một loại Lan không chịu được quá nóng hay
quá lạnh, lại không cần nhiều ánh sáng cho nên thích hợp trồng trong nhà hay
trong nhà kính. Nhiệt độ thích hợp nhất là từ 22 – 27
0
C. Khi cây đang ra nụ,
nhiệt độ hay độ ẩm thay đổi bất thường sẽ làm cho nụ hoa héo rụng.
- Ánh sáng: Trong nhà kính phải dùng lưới che bớt ánh sáng vì hoa Lan
chỉ cần từ 1000 cho đến 1500 ánh nến. Nuôi trong nhà, cần để lan ở gần cửa
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 9
sổ có ánh nắng hoặc không cũng được. Có thể dùng 4 chiếc đèn ống 40W và
2 bóng đèn thường, cách ngọn cây Lan khoảng 6-10" từ 12-16 giờ mỗi ngày:
12 giờ cho cây lớn và 16 giờ cho cây nhỏ.
- Tưới nước: Không bao giờ để Lan quá khô, mùa hè nên tưới thật đẫm
2 lần một tuần. Mùa đông 10 ngày tưới một lần. Nên tưới vào buổi sáng để lá
cây sẽ khô trước khi đêm xuống. Nếu để nước đọng vào ngọn, lá non dễ bị
thối và cây sẽ chết.
- Độ ẩm: Hoa Lan cần độ ẩm từ 50-80%. Để chậu Lan trên khay nước
có xếp đá sỏi cho có đủ độ ẩm cần thiết.
virus.
- Giai đoạn 2: Giai đoạn nuôi khởi động
Tạo mẫu vô trùng trong ống nghiệm. Đây là giai đoạn cực kì quan
trọng trong quy trình nuôi nhân giống nào, yêu cầu tạo được mẫu vô trùng và
phát triển trong ống nghiệm. Chọn loại mô thích hợp để đưa vào ống nghiệm
là mô trẻ, mô dễ tái sinh, ưu tiên mẫu không cần qua khử trùng hoặc dễ khử
trùng như đỉnh sinh trưởng.
Khử trùng mẫu thường dùng các chất như cồn H
2
O
2
, HgCl
2
… Yêu cầu
làm tiệt trùng mẫu mà không làm tổn hại đến mẫu, duy trì được khả năng tái
sinh của mẫu.
Trình tự khử trùng:
Dùng cồn 70 độ khử trùng lớp sáp bên ngoài. Chú ý chọn nồng độ thích
hợp và thời gian khử trùng phù hợp.
Sau khi khử trùng loại bỏ chất khử trùng bằng tráng nước vô trùng
nhiều lần, cắt bỏ phần mô tiếp xúc với chất khử trùng. Sau đó cấy vào môi
trường.
- Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả của toàn bộ quy trình. Các yếu tố
ảnh hưởng đến quá trình như: Loại môi trường, các chất điều hoà sinh trưởng,
vi lượng, nồng độ, tương tác giữa các chất, các muối khoáng đa lượng, vi
lượng, các vitamin, phụ gia hữu cơ, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, chế độ cấy
chuyển,…
- Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Cho tới nay thì hầu hết các loài hoa Lan đã được nhân nhanh bằng cách
sử dụng phương pháp NCM tế bào đã có rất nhiều những cuộc hội thảo về hoa
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 18
Lan được tổ chức trên thế giới đặc biệt là các nước thuộc khu vực Châu Á.
Những nghiên cứu chi tiết cho từng loại, từng giống ở từng khu vực đã và
đang được các nhà khoa học nghiên cứu đưa ra những quy trình những cải
tiến ngày một hoàn chỉnh hơn.
+ Các phương pháp nhân giống in vitro hoa Lan
a. Nuôi cấy in vitro hoa Lan bằng cách sử dụng chồi đỉnh
Kết quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc rất nhiều vào mẫu nuôi
cấy, nguồn gốc và kích thước của mẫu. Tốt nhất là chúng ta lấy mẫu từ chồi
đỉnh đang ở thời kì sinh trưởng mạnh (Gup et al, 1981). Đỉnh sinh trưởng của
những cây non tốt hơn cây già. Điều kiện sinh trưởng, thời vụ lấy mẫu cũng
có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả tái sinh của mẫu nuôi cấy.
Những công việc của Morel 1960 về nuôi hoa Lan hầu hết là sử dụng
chồi đỉnh. Mored (1960, 1964) đã sử dụng những chồi đỉnh có kích thước rất
nhỏ (0,1 mm) để lấy meristem.
Những cộng sự của ông và các nhà khoa học khác sau đó sử dụng
những chồi đỉnh có kích thước lớn hơn (khoảng 3-5cm). Theo cách này thì có
thể sẽ không làm sạch được virus nếu như cây mẹ đã nhiễm bệnh. Vì vậy mà
người ta đã tách ra như sau:
Nếu cây mẹ sử dụng để lấy mẫu đã được xác định là hoàn toàn sạch
virus thì có thể sử dụng những chồi đỉnh có kích thước từ 3-5mm để đưa vào
nuôi cấy. Với những kích thước mẫu nuôi cấy này thì sẽ giảm thiểu đáng kể
đến sự chết của mẫu và tăng cao khả năng tái sinh. Nếu cây mẹ bị nhiễm virus
thì phải lấy chồi đỉnh có kích thước 0,1-0,2mm với 1-2 lớp lá bao đưa vào
nuôi cấy thì sẽ tránh được nhiễm virus.
nhân giống không có khả năng làm giảm được bất lợi trong kỹ thuật này. Do
sự không đồng nhất đó một số vấn đề lớn phải giải quyết đó là sự thay đổi
trong sinh trưởng, thời gian ra hoa và những đặc tính của hoa. Những thay đổi
đã làm tăng giá thành sản xuất, giảm lợi nhuận (Ken Tokuhara and Masahiro
mii, 1993). Hơn nữa việc nhân giống bằng chồi nách của Phalaenopsis là rất
hãn hữu do khả năng đẻ chồi của nó rất hiếm.
Một số phương pháp vi nhân giống như Phalaenopsis được đưa ra bao
gồm nuôi cấy cuống hoa cùng chồi nách (Intwong et at, 1972, Reiginger et at,
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 20
1976), chồi đỉnh của những chồi từ cuống hoa (Zimmer and Pieper 1978,
Ichihashi 1992) những đoạn của cuống hoa (Homma and Asahira 1895, Lin
1986). Ở phương pháp này người ta sử dụng những phát hoa của cây đang ở
thời kì hình thành nụ nhỏ, cắt mỗi đoạn phát hoa có mang một mắt chồi, loại
bỏ lớp áo bao phía ngoài rồi thực hiện các bước khử trùng. Sau đó tách bỏ 2-3
lớp lá từ chồi. Phần chồi đỉnh đạt được kích thước rộng 1mm, cao 0,5mm và
có 1-2 lá bao được cắt ra từ đoạn cuống của phát hoa.
d. Nuôi cấy mô lá
Sử dụng mô lá làm nguồn vật liệu cho nuôi cấy được thực hiện khá thành
công trên một số đối tượng như: hoa cúc, thuốc lá… đối với hoa Lan việc sử
dụng mô lá để làm nguồn mẫu ban đầu lại càng có ý nghĩa hơn bởi việc sử
dụng chồi đỉnh sẽ dễ dàng làm hy sinh luôn cả cây đó. Hoặc khi sử dụng chồi
nách một phần của cây sẽ bị phá huỷ, cả hai phương pháp này đều làm ảnh
hưởng tới sinh trưởng của toàn bộ cây mẹ hoặc nó bị ức chế tới các chức năng
khác. Trong khi việc sử dụng phát hoa, lá, rễ cũng gây hại cho cây nhân giống
đầu tiên.
Phương pháp sử dụng mô lá được thực hiện trên một số đối tượng như
Cattleya, EpiDendrobium và Laelio Cattleya. Nguồn mẫu lấy từ lá non của
Một trong những nhân tố quan trọng nữa là cytokinin (Letham 1974,
Van Standen and Drewes, 1975). Tuy nhiên tuỳ theo đối tượng mẫu, phát hoa,
mô lá hay tính trạng của mẫu (đã cấy chuyển nhiều lần hay chưa) mà ta sử
dụng chủng loại, nồng độ cho thích hợp với từng loại mẫu, từng thời kì. Vì đa
số các loài hoa Lan là tương đối nhạy cảm với sự có mặt của các chất điều tiết
sinh trưởng bổ sung vào trong môi trường đặc biệt với mẫu đã qua một số lần
cấy chuyển.
Việc bổ sung các chất phụ gia khác (dịch chiết của một số loại như:
khoai tây, chuối, đu đủ, cà rốt…) là hết sức có ý nghĩa đối với quá trình nhân
giống in vitro hoa Lan. Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 22
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu là giống Lan Hồ Điệp hoa trắng tuyền
(Phalaenopsis amabilis)
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu giống Lan Hồ Điệp: ngồng
hoa và nụ hoa non.
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Để xây dựng qui trình nhân nhanh giống Lan Hồ Điệp, chúng tôi đã
tiến hành các thí nghiệm in vitro. Qui trình nhân giống gồm 5 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
- Giai đoạn 2: Tạo thể nhân nhanh in vitro
- Giai đoạn 3: Nhân nhanh in vitro
- Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh
5
3
1
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 23
Các thí nghiệm này được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm,
Viện Di Truyền Nông Nghiệp. Nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Nghiên cứu hiệu quả khử trùng của HgCl
2
và H
2
O
2
ở các thời gian,
nồng độ khác nhau.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến khả
năng sinh trưởng và phát triển chồi của các mẫu nuôi cấy.
- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm và đưa cây ra
vườn ươm.
Các thí nghiệm nghiên cứu được thực hiện:
3.2.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng đối với
ngồng hoa Lan Hồ Điệp
Mẫu ban đầu được lau qua cồn 70
B3: MS + 1,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B4: MS + 1,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B6: MS + 2,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B5: MS + 2,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với
0,1mg/l IAA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở nụ hoa (tính theo tỷ lệ %)
TD1: MS + 0 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD2: MS + 0,1 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD3: MS + 0,2 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD4: MS + 0,3 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD5: MS + 0,4 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD6: MS + 0,5 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD7: MS + 0,6 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30g/l đường + 6g/l Agar
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chất bổ sung vào môi trường đến biểu hiện
phân hoá mô sẹo của Lan Hồ Điệp
Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất: 1000 mg/l casein hydrolysate,
1000 mg/l malt extract, 60 g/l maltose và sucrose, 60 g/l glutose và sucrose,
60 g/l sucrose.
3.2.3. Giai đoạn nhân nhanh in vitro
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và nồng độ BAP = 1,0 mg/l
đến khả năng tạo chồi của Lan Hồ Điệp
N1: MS + 1,0 mg/l BAP + 0 mg/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N2: MS + 1,0 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N3: MS + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N4: MS + 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N5: MS + 1,0 mg/l BAP + 1,5 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N6: MS + 1,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
g/l đường + 6 g/l Agar
Copyright: Tài liệu đại học ©