Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TRẦN THỊ NGỌC DIỆP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (ZEA MAYS L.)

luËn v¨n th¹c sÜ sinh häc


Mã số: 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ng-êi h-íng dÉn khoa häc: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU Thái Nguyên: 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, chưa có ai công bố. Tác giả

Trần Thị Ngọc Diệp


Tác giả
Trần Thị Ngọc Diệp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan………………………………………………………
i
Lời cảm ơn………………………………………………………………
ii
Mục lục………………………………………………………………
iii
Những chữ viết tắt……………………………………………………….
vi
Danh mục các bảng………………………………………………
vii
Danh mục các hình………………………………………………
viii
MỞ ĐẦU…………………………………………………………
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
hình độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)…………………………….
14
1.2.1.3. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn
giản)……………………………………………………………………

15
1.2.1.4.Bản đồ QTL (Quantiative Trait loci)…………………………
17
1.2.1.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)……
17
1.2.2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở thực vật bằng kỹ thuật RAPD
20
1.2.3.Tình hình nghiên cứu sự đa dạng di truyền của ngô bằng kỹ thuật RAPD
22
1.3. NHẬN XÉT CHUNG……………………………………
24
Chƣơng 2 . VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………
25
2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU………………………………………
25
2.1.1.Vật liệu thực vật…………………………………………………
25
2.1.2.Hoá chất…………………………………………………
25
2.1.3.Thiết bị………………………………………………………
26
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………
26

35
3.2.1.Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá ngô
35
3.2.2.Kết quả nghiên cứu đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD
37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
50
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT


1.1
Thành phần hoá học của hạt ngô và gạo (Phân tích trên 100)…
8
1.2
Dự báo nhu cầu ngô thế giới đến năm 2020………………
9
1.3
Tình hình sản xuất ngô của một số khu vực trên thế giới
giai đoạn 2005 – 2007……………………………………

10
1.4
Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới
năm 2007…………………………………………………

11
1.5
Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2006
13
2.1
Đặc điểm 14 giống ngô nghiên cứu………………………
25
2.2
Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong
nghiên cứu………………………………………………….

29
2.3
Thành phần phản ứng RAPD……………………………….
30

35
3.3
Phổ hấp thụ DNA của giống SLV đo ở bước sóng 260 nm.
37
3.4
Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M1 của 14
giống ngô………………………………………………….

39
3.5
Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 của 14
giống ngô………………………………………………….

40
3.6
Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M4 của 14
giống ngô………………………………………………….

41
3.7
Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M6 của 14
giống ngô………………………………………………….

42
3.8
Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M8 của 14
giống ngô………………………………………………….

43
3.9

chế biến trên toàn thế giới. Hiện nay, diện tích ngô trên thế giới vào khoảng
135 - 140 triệu ha, với sản lượng trung bình là 600 - 700 triệu tấn.
Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông
dân vùng trung du và miền núi phía Bắc nói chung và cây lương thực chính
của đồng bào dân tộc thiểu số vùng cao nói riêng [1]. Trong những năm gần
đây sản xuất ngô ở Việt Nam tăng lên nhanh nhờ sự thúc đẩy của ngành chăn
nuôi và công nghiệp chế biến. Đặc biệt từ những năm 1990 trở lại đây, diện
tích, năng suất và sản lượng ngô tăng liên tục là nhờ ứng dụng những tiến bộ
khoa học kỹ thuật mới vào sản xuất mà tiêu biểu là đưa ngô lai vào trồng trên
diện tích rộng. Các giống ngô ở nước ta hiện nay rất phong phú gồm các
giống ngô nhập nội, giống lai tạo, giống tổng hợp, giống đột biến và các
giống ngô địa phương [20].
Bên cạnh các giống ngô lai có năng suất cao đang được trồng phổ biến ở
nhiều vùng trong cả nước, thì các giống ngô địa phương tuy có năng suất thấp
nhưng chất lượng hạt cao, chất lượng ngô dẻo, thơm, ngon và chống chịu sâu
bệnh tốt.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để nghiên cứu sự đa dạng di truyền
của các giống cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng như RFLP, AFLP,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
SSR, STS, RAPD, Các phương pháp này khắc phục được nhược điểm của
các phương pháp chọn giống truyền thống bởi đánh giá được hệ gen của cây
trồng.
Những năm gần đây, diện tích trồng các giống ngô địa phương ngày
càng có xu hướng giảm, nhiều giống ngô nếp quý hiếm sẽ bị mất dần. Như
vậy, việc sưu tập và nghiên cứu các giống ngô nếp địa phương góp phần bảo
tồn nguồn gen cây ngô là rất cần thiết.
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức DNA và đặc điểm hóa sinh ở
giai đoạn hạt là cơ sở khoa học để đề xuất việc chọn những giống ngô có năng

ngô nửa răng ngựa. Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được
phân chia thành các thứ. Ngoài ra ngô còn được phân loại theo sinh thái
học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [12].
Có rất nhiều giả thuyết về nguồn gốc của ngô tại châu Mỹ như ngô là
sản phẩm thuần dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (Zea mays ssp. parviglumis) một
năm ở Trung Mỹ, có nguồn gốc từ khu vực thung lũng sông Balsas ở miền
nam Mexico. Cũng có giả thuyết khác cho rằng ngô sinh ra từ quá trình lai
ghép giữa ngô đã thuần hóa nhỏ (dạng thay đổi không đáng kể của ngô dại)
với cỏ ngô thuộc đoạn Luxuriantes. Song điều quan trọng nhất nó đã hình
thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng
cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị
đứng cạnh lúa mì và lúa nước [12].
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây ngô
Cơ quan sinh dưỡng của ngô gồm rễ, thân và lá làm nhiệm vụ duy trì
đời sống cá thể. Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây.
Sau khi gieo hạt, ngô phát triển thành mầm. Cây mầm chủ yếu sử
dụng nguồn dinh dưỡng chứa trong nội nhũ hạt. Bộ phân phía trên hạt phát
triển lên mặt đất gồm có trụ giữa lá mầm. Phần đỉnh trụ lá mầm có mấu bao
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
lá mầm, từ đó phát sinh bao lá mầm và bên trong bao lá mầm là thân lá
mầm. Trên trục của cây mầm, một đầu hình thành rễ cây mầm, sau đó phát
triển thành rễ chính, từ rễ chính hình thành các rễ phụ. Ngô là cây có rễ
chùm tiêu biểu cho bộ rễ cây hòa thảo. Hệ rễ có ba loại: rễ mầm, rễ đốt và
rễ chân kiềng. Rễ đốt giúp cho cây hút nước và các chất dinh dưỡng. Rễ
chân kiềng mọc xung quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này
giúp cây chống đổ, đồng thời cũng tham gia vào hút nước và thức ăn cho
cây. Số lượng rễ, số lông rễ và chiều dài rễ khác nhau ở mỗi giống.
Thân ngô thường phát triển mạnh, thẳng cứng dạng bền chắc. Thân

C. Ở các thời kỳ sinh trưởng khác nhau thì sự hút chất
dinh dưỡng cũng như yêu cầu về dinh dưỡng của ngô cũng khác nhau: Ở
thời kỳ đầu cây ngô hút chất dinh dưỡng chậm, thời kỳ từ 7 - 8 lá đến sau
trỗ 15 ngày toàn bộ các bộ phận trên mặt đất cũng như các bộ phận dưới
mặt đất của cây ngô tăng trưởng nhanh, các cơ quan sinh trưởng phát triển
mạnh, lượng tinh bột và chất khô tăng nhanh. Đây là giai đoạn cây ngô hấp
thu chất dinh dưỡng tối đa (bằng 70 - 90% dinh dưỡng cả vòng đời cây
hút). Ở thời kỳ này nếu cây thiếu nước và chất dinh dưỡng sẽ làm giảm
năng suất từ 10 - 20%. Trong các yếu tố dinh dưỡng thì đạm là nguyên tố
dinh dưỡng quan trọng bậc nhất của cây ngô (Lê Đức Biên,1986) [2].
1.1.3. Vai trò cây ngô trong nền kinh tế
Ngô làm lương thực cho con người: Ngô là cây lương thực nuôi sống
gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng ngô nói chung đều
ăn ngô ở mức độ khác nhau. Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm
lương thực cho người. Các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng
ngô làm lương thực chính. Các nước Đông Nam Phi sử dụng 85% sản
lượng ngô làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%,
Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đông Nam Á và Thái Bình Dương 39%, Đông Á
30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe 61% Nếu như ở Châu Âu khẩu phần
ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; Châu Á: cơm (gạo), cá, rau xanh
(canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Vì vậy, trên phạm vi
thế giới, ngô vẫn còn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngô rất phong
phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
Ngô làm thức ăn gia súc: Ngô là thức ăn gia súc quan trọng nhất hiện
nay. Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô, điều đó phổ
biến trên toàn thế giới. Ngoài việc cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức
ăn xanh và ủ chua lí tưởng cho đại gia súc.

Hạt ngô chứa tinh bột, lipid, protein, đường (chiếm khoảng 3,5%), chất
khoáng (chiếm khoảng 1 – 2,4%), vitamin (gồm vitamin A, B1, B2, B6, C
và một lượng rất nhỏ xenlulo (2,2%).
Hạt ngô chứa phần lớn tinh bột, hàm lượng tinh bột trong hạt thay
đổi trong giới hạn 60 - 70%. Hàm lượng tinh bột ở ngô tẻ nhiều hơn ngô
nếp (68% so với 65%). Tinh bột tập trung chủ yếu ở nội nhũ và được chia
thành hai dạng tinh bột là tinh bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh
bột sừng hay tinh bột phalê).
Hàm lượng lipid cao thứ hai trong các loại ngũ cốc sau lúa mạch, nó
chiếm khoảng (3,5 – 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên.
Lipid được tập trung nhiều ở phôi và màng alơron. Dầu ngô chứa đến 50%
acid linoleic liên kết với glyxerit, acid oleic, panmitic, ricinic. Hàm lượng
lipid là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt [9].
Protein của ngô được chia thành 3 dạng chính: protein hoạt tính (chủ
yếu là emzyme), protein cấu tạo và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ
chiếm tỉ lệ cao nhất. Hàm lượng protein dao động từ 4,8 đến 16,6,% tùy
vào mỗi giống. Lợi dụng tính chất hòa tan của protein trong các dung môi,
người ta có thể tách triết protein tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích
nghiên cứu như đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn…
Thành phần hoá học của hạt ngô vàng đều cao hơn so với gạo trắng.
Ngoài thành phần tinh bột, protein, lipid, ở ngô còn chứa nhiều loại
vitamin, trong đó vitamin C cao nhất. Về nhiệt lượng của ngô cao hơn gạo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
trắng là 10%. Qua đó cho thấy, ngô là cây lương thực có giá trị dinh dưỡng
tương đối cao (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Thành phần hoá học của hạt ngô và gạo (Phân tích trên 100g)
Thành phần hóa học
Gạo trắng

triệu ha, năng suất bình quân khoảng 3,8 triệu tấn/ha, tổng sản lượng ngô
trên 525 triệu tấn/ ha. Ngô là cây có địa bàn phân bố vào loại rộng nhất thế
giới, trải rộng hơn 90 vĩ tuyến: Từ 40
0
N lên gần đến 55
0
B, từ độ cao 1 - 2
m đến 400 m so với mực nước biển [13]. Do đó, ngô được trồng ở hầu hết
các nơi trên thế giới như Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi.
Theo dự báo của Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới
(IPRI, 2003), vào năm 2020 tổng nhu cầu ngô thế giới là 852 triệu tấn,
trong đó 15% dùng làm lương thực, 69% dùng làm thức ăn chăn nuôi, 16%
dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp. Ở các nước phát triển chỉ dùng 5%
ngô làm lương thực nhưng ở các nước đang phát triển sử dụng 22% ngô
làm lương thực (IPRI, 2003) Đến năm 2020, nhu cầu ngô thế giới tăng 45%
so với nhu cầu năm 1997, chủ yếu tăng cao ở các nước đang phát triển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
(72%), riêng Đông Nam Á nhu cầu tăng 70% so với năm 1997 (Bảng 1.2),
sở dĩ nhu cầu ngô tăng mạnh là do dân số thế giới tăng, thu nhập bình quân
đầu người tăng, nên nhu cầu thịt, cá, trứng, sữa tăng mạnh, dẫn đến đòi hỏi
lượng ngô dùng cho chăn nuôi tăng. Nhưng thách thức lớn nhất là 80% nhu
cầu ngô thế giới tăng (266 triệu tấn), lại tập trung ở các nước đang phát
triển. Hơn nữa chỉ khoảng 10% sản lượng ngô từ các nước công nghiệp có
thể xuất sang các nước đang phát triển. Vì vậy, các nước đang phát triển
phải tự đáp ứng nhu cầu của mình (IPRI, 2003).
Bảng 1.2. Dự báo nhu cầu ngô thế giới đến năm 2020
Vùng
Năm 1977

18
28
56
(Nguồn: Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới IPRI, 2003)
Theo Đại học Tổng hợp Iowa (2006), trong những năm gần đây khi thế
giới cảnh báo nguồn dầu mỏ đang cạn kiệt, thì ngô đã và đang được chế biến
ethanol, thay thế một phần nhiên liệu xăng dầu chạy ô tô tại Mỹ, Braxin,
Trung Quốc, Riêng ở Mỹ, năm 2002 - 2003 đã dùng 25,2 triệu tấn ngô để
chế biến ethanol, năm 2005 - 2006 dùng 40,6 triệu tấn và dự kiến năm 2012
dùng 190,5 triệu tấn ngô (Oxfarm, 2004). Diện tích, năng suất, sản lượng ngô
giữa các châu lục trên thế giới có sự chênh lệch tương đối lớn được thể hiện
bảng 1.3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
Bảng 1.3. Tình hình sản xuất ngô của một số khu vực trên thế giới
giai đoạn 2005 – 2007

Khu vực
Diện tích
(Triệu ha)
Năng suất
(Tạ/ha)
Sản lƣợng
(Triệu tấn)

2005

2006


167,3
183,3
185,4
Bắc và
Trung Mỹ
39,9
40,9
41,3
72,6
81,6
75,7
289,6
333,7
312,0
Thế giới
144,3
146,9
147,0
44,5
49,9
41,7
642,5
724,2
692,0
(Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008)
Qua bảng 1.3 cho thấy: Diện tích trồng ngô giữa các Châu lục có sự
chênh lệch nhau trong đó Châu Á là khu vực có diện tích trồng ngô lớn
nhất, năm 2005 là 43,7 triệu ha đến năm 2007 là 46,4 triệu ha, chiếm
khoảng 31,6% diện tích ngô toàn thế giới. Đứng ở vị trí thứ hai là khu
vực Bắc và Trung Mỹ chiếm khoảng 28% diện tích trồng ngô thế giới.

Bảng 1.4. Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 2007
Tên nƣớc
Diện tích
(Triệu ha)
Năng suất
(Tạ/ha)
Sản lƣợng
(triệu tấn)
Italy
1,06
93,15
10,62
Mỹ
30,08
100,64
280,22
Hy lạp
0,84
80,95
6,80
Canada
1,08
77,43
8,39
Trung Quốc
26,22
50,01
131,15
Ấn Độ
7,40

trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. Là cây lương
thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây trồng chính để phát triển ngành
chăn nuôi. Năng suất ngô ở nước ta trước đây rất thấp so với năng suất ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
thế giới, do sử dụng giống ngô địa phương và áp dụng khoa học kỹ thuật vào
sản xuất còn hạn chế. Phải tới năm 1991 cây ngô lai mới bắt đầu được đưa
vào sản xuất ở nước ta, tỷ lệ trồng giống lai từ 0,1% năm 1990, năm 2006 đã
tăng lên 80% và đưa Việt Nam trở thành nước sử dụng giống lai nhiều và có
năng suất cao của khu vực Đông Nam Á.
Bảng 1.5. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2006
Năm
Diện tích
(1000 ha)
Năng suất
(Tạ/ha)
Sản lƣợng
(1000 tấn)
2004
991,10
34,6171
343,09
2005
1052,60
35,6859
375,63
2006
1031,60
37,024

kém và mất thời gian. Phương pháp này đòi hỏi một lượng DNA lớn (50 –
200ng từ mỗi cá thể) [6].
Ignjatovic-Micic D. và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với
kỹ thuật RAPD để xác định quan hệ di truyền của 2178 giống ngô địa
phương. Kết quả xác định khoảng cách di truyền dao động từ 0,1311 đến
0,5075. Tác giả kết luận, dữ liệu phân tích RAPD và RFLP đều cho kết quả
giống nhau nên có thể dùng cả hai phương pháp này để xác định đa hình di
truyền [33].
Moretti A và cs (2008) đã sử dụng RFLP để xác định quan hệ di truyền
của Fusarium subglutinans gây bệnh ở ngô [37].
1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa
hình độ dài các đoạn đƣợc nhân bản chọn lọc)
Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR. AFLP phát hiện
một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen được cắt bởi enzyme giới hạn và
gắn với adaptor (đoạn tiếp hợp). AFLP hoạt động dựa trên nhiều nguyên tắc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
tương tự như RAPD, tuy nhiên có điểm khác biệt là mồi bao gồm hai phần:
phần cố định dài khoảng 15 bp chứa điểm nhận biết của enzyme giới hạn,
phần thay đổi dài khoảng 2-4 bp. Phân tích sản phẩm PCR được điện di trên
gel polyacryamide có độ phân giải cao. Sự đa hình được xác định bởi sự có
mặt hay không có mặt của một phân đoạn DNA. AFLP rất có hiệu quả trong
xác định quan hệ di truyền và lập bản đồ. Hiện nay, phân tích AFLP sử dụng
phương pháp nhuộm bạc nên dễ áp dụng, tuy giá thành cao hơn với phương
pháp RAPD. Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tích đa hình trong khoảng
thời gian ngắn, đòi hỏi lượng DNA ít, cho sự đa hình cao, tuy nhiên việc thiết
kế mồi rất phức tạp.
Kỹ thuật AFLP được Miranda Oliverira K. và cs, (2004) sử dụng để đánh
giá mối quan hệ di truyền của 96 dòng ngô lai cùng dòng, kết quả thu được