1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên tài nguyên thực vật rất
dồi dào, với diện tích rừng của Việt Nam chúng ta thấy được sự đa dạng các
loài trong hệ sinh thái thực vật là vô cùng phong phú. Với mục tiêu trồng rừng
phát triển kinh tế, tạo nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp cũng như
các làng nghề thì sản phNm từ rừng của chúng ta phải ngày càng được nâng
cao cả về chất lượng và sản lượng.
Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) là một trong những
loài lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế cao. Song mật có đường kính lớn, dài,
bền, dẻo, dễ uốn và chịu lực tốt nên đây là nguyên liệu sử dụng trong các làng
nghề mây tre đan trên cả nước.
Với sự quan tâm đầu tư của nhà nước cho các cơ sở sản xuất tiểu thủ
công nghiệp thì số lượng sản phNm từ các làng nghề mây tre đan ngày càng
tăng nhưng tỷ lệ nghịch với sự gia tăng này chính là sự giảm sút nghiêm trọng
của nguyên liệu đầu vào. Theo thống kê, khoảng 35 – 42% các cơ sở mây tre
đan đang phải sản xuất cầm chừng và có nguy cơ đóng cửa vì thiếu và không
chủ động được nguyên liệu. Việc thiết lập những vùng nguyên liệu chuyên
canh tập trung Song mật là một nhu cầu bức bách đối với nước ta hiện nay.
Trên cả nước đã có nhiều tỉnh triển khai việc nhân giống Song mật
nhưng công tác nhân giống chỉ mang tính gây trồng và bằng hình thức gieo
ươm hạt tạo cây con rồi đưa vào trồng rừng sản xuất nhưng với song mây
trong giai đoạn phát triển của chúng luôn phải trải qua giai đoạn cỏ. Đây là
giai đoạn mà cây con tạo nhiều chồi, thời gian để các chồi phát triển là rất lâu,
điều này kéo theo sự chậm phát triển của cây trồng. Để khắc phục giai đoạn
cỏ này hiện nay chỉ có thể bằng các phương pháp nuôi cấy invitro.
Giải quyết vấn đề thiếu nguồn nguyên liệu và suy giảm nhanh chóng
nguồn tài nguyên thực vật này ngày 12 tháng 5 năm 2008 Bộ trưởng Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra quyết định số 1462/QĐ/BNN-KHCN về
việc: “Nghiên cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro”
hiệu quả. Đánh dấu bằng sự ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử, nhờ đó
mà sự biến đổi di truyền được nghiên cứu trực tiếp ở cấp độ ADN và có thể
phát hiện ra lượng lớn tính đa hình tạo ra do đột biến. Vì vậy, làm cho kết quả
của việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phong phú, chính xác hơn so với
chỉ thị hình thái.
Một số kỹ thuật ADN hiện đang được sử dụng phổ biến là đa hình độ
dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism –
RFLP) và các kỹ thuật dựa vào chuỗi phản ứng Polymerase Chain Reaction
(PCR) như: đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified
Polymorphism ADN – RAPD); Microsatellite hay còn gọi là đa hình các đoạn
lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat – SSR); Đa hình độ dài các đoạn
nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP); . . .
Tuy nhiên, không có kỹ thuật sinh học phân tử lý tưởng nào đáp ứng
được tất cả các chỉ tiêu, mỗi loại đều có những thế mạnh và hạn chế riêng.
1.1.1. Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length
Polymorphism – RFLP)
Kỹ thuật RFLP (Bot Stein, et al., 1980), dùng các cADN hoặc ADN
ngẫu nhiên trong hệ gen như các mẫu dò, các mẫu dò này được đánh dấu bằng
phóng xạ hoặc enzyme tiếp hợp để phát hiện các đoạn ADN có độ dài khác
nhau được tạo ra khi sử dụng các enzyme hạn chế để cắt ADN hệ gen và phân
tách bằng phương pháp điện di trên gel [26]. Nếu trình tự nhận biết có mặt ở
một vị trí trên hệ gen của một cá thể nhưng không có mặt ở cá thể khác,
enzyme sẽ tạo ra các đoạn hạn chế có kích thước khác nhau ở vị trí này. Kết
quả làm phát sinh hàng ngàn đoạn ADN có kích thước khác nhau.
4
RFLP là chỉ thị đồng hợp trội, các đoạn ADN từ tất cả các nhiễm sắc
thể (NST) đồng dạng đều được phát hiện. Vì vậy, RFLP là chỉ thị rất đáng tin
cậy trong phân tích liên kết và chọn giống. RFLP có thể xác định một đặc
điểm liên kết ở trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của một cá thể, đây là
Kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nghiên cứu những biến đổi trong
vật liệu di truyền của cơ thể sống ở mức ADN. Biến đổi di truyền được
nghiên cứu trực tiếp ở mức độ ADN có thể phát hiện ra một lượng lớn sự đa
hình tạo ra do đột biến, vì vậy làm cho chúng phong phú hơn so với chỉ thị
hình thái. Để phân biệt các xuất xứ khác nhau, có thể dùng nhiều phương
pháp. Một trong những phương pháp đem lại hiệu quả cao, chính xác, rút
ngắn được thời gian và công sức là dùng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu sự
đa dạng di truyền bởi nó cho phép chúng ta hiểu biết về thành phần gen giữa
các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau làm cơ sở cho việc
xác định xuất xứ [1, 4].
Sự ra đời của PCR đã làm thay đổi lớn trong sinh học phân tử, đánh
dấu sự ra đời của hàng loạt chỉ thị phân tử: RAPD, AFLP, SSR.
1.1.2.1. Đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment
Length Polymorphism – AFLP).
AFLP được phát triển bởi Zabeau và Vos (1993) [30] và được mô tả
chi tiết bởi Vos và cộng sự (1995) [28]. AFLP là kỹ thuật di truyền mới dựa
trên cơ sở PCR, AFLP đã phối hợp được sự tin cậy của RFLP và sự thuận lợi
của kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này gồm ba bước:
(1) : Cắt ADN hệ gen bằng enzym giới hạn và gắn các đoạn
oligonucleotide tiếp hợp (adapter).
(2) : Nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn.
(3) : Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên.
Đây là kỹ thuật có nhiều ưu điểm trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở
nhiều đối tượng khác nhau: đậu tương [24], lập bản đồ hệ gen và định vị các
gen, phát triển chỉ thị chuNn ở khoai tây [8], ở lúa mỳ, xác định các gen kháng
virus ở đậu tương [28], ở khoai tây [11], ở lạc [13].
6
AFLP là một kỹ thuật có độ nhạy cao để phát hiện đa hình trong toàn
bộ hệ gen. AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả
Một chỉ thị khác của STS dựa trên kỹ thuật RAPD là SCARs (Sequence
Characterised Amplified Regions). Các chỉ thị này dựa trên việc tách dòng và
đọc trình tự các đoạn RAPD được quan tâm (có thể vì chúng liên kết với gen
được quan tâm), từ trình tự đã biết thiết kế các mồi dài hơn các mồi thường
dùng trong RAPD (24 nucleotide) bổ sung chính xác với trình tự đầu cuối của
đoạn RAPD ban đầu. Khi các mồi này được dùng trong PCR, một locus đơn
được xác định tương ứng với đoạn ADN ban đầu của locus này. SCARs tiến
bộ hơn RAPD là các kết quả có khả năng lặp lại (dùng mồi dài hơn) và là các
chỉ thị đồng trội.
Chỉ thị CAPS hay "Cleaved Amplified Polymorphic Sequences" [15]
cũng là một ví dụ của STS, được tạo ra bằng cách cắt các sản phNm PCR với
một enzym hạn chế. Chỉ thị ADN này vẫn mang những ưu điểm cơ bản của
PCR là chỉ cần một lượng nhỏ nanogram (ng) ADN và phát hiện dễ dàng nhờ
kết quả huỳnh quang. Các mồi PCR dài hơn (15 – 25 nucleotide) dùng cho
CAPS có xu hướng tạo ra những sản phNm ổn định hơn RAPD hoặc các kỹ
thuật mồi ngẫu nhiên khác.
Tuy nhiên, CAPS cũng có mặt hạn chế là các cá thể có liên hệ gần gũi
thường chứa các alen giống nhau. Điều này gây trở ngại nghiêm trọng trong
việc tạo cặp lai giữa các dạng khác nhau.
1.1.2.3. Chỉ thị đoạn lặp đơn giản (Simple sequence reapeats – SSR)
SSR còn gọi là Microsatillite được Litt và Luty (1989) [20] phát triển
thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử. Microsatellite là đơn vị lặp lại rất ngắn 1 –
5bp, chúng xuất hiện và phân bố ở gần tâm động hoặc đầu mút của các NST,
có vai trò giữ tính ổn định của bộ NST ở các quá trình phân bào trong hệ gen
của tất cả sinh vật nhân thực [5, 26].
Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để
nhân các đoạn trình tự SSR. Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn
8
đến thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện di
1.1.2.4. Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified
Polymorphism ADN – RAPD)
1.1.2.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD
Đây là một kỹ thuật phân tử dựa trên cơ sở của phản ứng PCR do
Welsh và Mc ClellADN, 1990; Williams và cộng sự, 1990 đề xuất. Kỹ thuật
RAPD sử dụng các mồi đơn có trình tự nucleotide ngẫu nhiên dài từ 9 – 12
nucleotide các mồi này thường có hơn 60%(G +C) để đạt được liên kết với
mẫu đủ mạnh. Các mồi ngẫu nhiên là ngắn nên khả năng nó tìm được những
điểm gắn theo nguyên tắc bổ sung trên ADN là không quá khó khăn. Điện di
kết quả nhân gen thu được điện di đồ gồm những băng, vạch ADN ở những vị
trí giống nhau trên bản gel. Khi bộ gen của các mẫu kiểm tra có sự khác nhau
(có đa dạng sinh học) cho kết quả khác nhau trên điện di đồ. Kết quả của phản
ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều đoạn ADN khác nhau về độ dài và trình tự. Một
mồi ngẫu nhiên có thể cho kết quả là có băng nhân bản với ADN từ nguồn
này nhưng lại không xuất hiện băng nhân bản với ADN từ nguồn khác [5, 12].
Sản phNm PCR gồm nhiều đoạn ADN có kích thước từ 200bp đến hơn
3kb. Sự khác nhau của các đoạn ADN được phát hiện khi điện di sản phNm
PCR trên gel agarose. Sự khác nhau của các đoạn nói chung là do đột biến ở
vị trí gắn mồi ngăn trở việc bắt cặp của mồi. Các đoạn này được ghi nhận như
các yếu tố di truyền Mendel trội trong một cơ thể lưỡng bội.
1.1.2.4.2. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật RAPD
RAPD là một phương pháp nhanh để phát hiện đa hình vì kỹ thuật này
không đòi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều locus cùng
một lúc.
Đây là một kỹ thuật có giá thành thấp, đơn giản, sử dụng lượng nhỏ
ADN khuôn, không dùng kỹ thuật lai và mẫu dò phóng xạ nên không đòi hỏi
kỹ thuật phức tạp. Vì vậy, trong những năm gần đây phân tích RAPD trở
thành phương pháp phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền và phân loại thực
vật, xác định các đặc điểm quan trọng và nguồn gốc.
25]. Cùng với RFLP hoặc SSR, RAPD được dùng để xây dựng bản đồ liên
11
kết di truyền (bản đồ có mật độ cao trong nhiều trường hợp) ở nhiều loài cây:
rau diếp, củ cải đường, lúa mạch... [17, 27, 29].
Trong một số ít trường hợp RAPD được dùng trong xác định QTL của
nhiều đặc điểm nông học như: các đặc điểm về năng suất ở lúa mạch và lúa,
trong xác định gen điều khiển các đặc điểm đơn gen ở cà, rau diếp [14, 17].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra RAPD là một phương pháp hữu hiệu để xác
định kiểu gen, phân tích quần thể và phả hệ, nghiên cứu phát sinh loài (hệ
thống phát sinh) và lập bản đồ di truyền.
1.2. Tình hình nghiên cứu về Song mật
Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) thuộc họ cau
(Arecaceae), nằm trong nhóm gỗ trung bình. Với giá trị sử dụng cao và được
người dân sử dụng từ rất lâu nên đã có nhiều nghiên cứu về Song mật.
1.2.1. Phân bố, đặc điểm hình thái Song mật
Song mật là loài cây ưa sáng và Nm, luôn vươn lên tầng cao nhất của
tán rừng. Mọc trên đất feralit vàng, trên núi đá và các loại đất phong hóa trên
phiến thạch, sa thạch, granit hoặc đá vôi. Cây thường mọc ven thung lũng núi,
chân và sườn núi đá, ven và dọc các khe Nm. Nơi có độ dốc 30 – 50
o
cũng
thấy Song mật. Song mật mọc xen lẫn rừng Tre, Vầu ở độ cao 100 – 1,500m,
tập trung nhiều ở độ cao 400 – 900m. Trên thế giới, Song mật chủ yếu tập
trung nhiều ở Trung Quốc, Việt Nam và một số nước khác. Ở Trung Quốc
Song mật chủ yếu phân bố ở tỉnh Vân Nam, mọc trên núi cao hơn 900m thành
từng cụm lớn. Ở Việt Nam đây là loài cây cận đặc hữu thường gặp ở ở các
tỉnh từ Đồng Nai (Nam Cát Tiên) trở ra nhưng tập trung nhất ở các tỉnh:
Quảng Nam, Quảng Bình, Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hoá, Ninh Bình, Hòa
Bình, Hà Nội, Phú Thọ, Yên Bái, Lào Cai,Tuyên Quang, Bắc Kạn, Lai Châu
10 – 11 dương lịch. Thời gian chín của quả kéo dài khoảng một tháng [2].
Quả hình trứng, dài 15 – 22mm, rộng 9 – 14mm, cuống mập màu xanh
vàng, dài 6mm, đỉnh có mũi hình nón dài 4mm; vỏ quả mang 18 hàng vảy
dọc, mỗi hàng 8 vảy dẹp, có rãnh kích thước 3 × 3,5mm mép màu nâu. Khi
13
non quả màu xanh lá cây, khi già màu vàng nhạt. Cùi quả màu trắng nhạt,
mọng nước, dài 1mm, dễ dóc khỏi hạt, cùi có vị chua [2].
Hạt hình trái xoan hay bầu dục, khi non màu trắng ngà, khi già màu nâu
đen. Vỏ ngoài hạt rất cứng, nhăn nheo, màu trắng đục, phía bụng là rốn hạt,
phía đầu to có lỗ với nắp đậy, qua đó phôi sẽ xuất hiện khi nảy mầm. Hạt
chứa nội nhũ, sừng rất cứng, phôi nằm lệch về một phía.
1.2.2. Giá trị và hiện trạng khai thác Song mật trên cả nước.
Thân Song mật dài, rất dẻo, chịu uốn và bền, nên được dùng làm bàn
ghế, hàng mây tre đan và cuốn bè. Hiện nay, Song mật là loại nguyên liệu
quan trọng trong nhiều cơ sở sản xuất mây tre đan ở các tỉnh phía Bắc. Trên
thị trường giá Song mật đắt hơn giá các loài song mây khác từ 2 – 3 lần. Hiện
nguồn Song mật dùng cho chế biến, sử dụng vẫn chủ yếu dựa vào việc khai
thác từ rừng tự nhiên.
Theo đánh giá của các chuyên gia lâm nghiệp, từ những năm 1985
Song mật đã bị khai thác mạnh để làm hàng xuất khNu khiến cho nhiều khu
phân bố thu hẹp dần số cá thể và có nguy cơ bị mất nguồn giống. Nguồn tài
nguyên Song mật đang cạn kiệt, vì vậy trên cả nước cần xây dựng những rừng
giống và khoanh vùng một số khu vực còn nhiều cá thể để khai thác hợp lý,
đảm bảo sản lượng ổn định, lâu dài. Song mật rất thích hợp phát triển trong
các rừng của Việt Nam nên phải có kế hoạch bảo vệ, khai thác, đNy mạnh
công tác gieo trồng và sử dụng bền vững. Trước tiên cần có kế hoạch tích cực
bảo vệ cây Song mật trong các khu bảo tồn để làm nguồn giống; đặc biệt cần
bảo vệ các cây Song mật đã được trồng ở Trạm nghiên cứu Lâm nghiệp Bình
Thanh, tỉnh Hoà Bình và vườn quốc gia Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ để lấy giống
cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro” đã đặt công tác
đánh giá chất lượng nguồn giống nuôi trồng là giai đoạn đầu tiên để kết quả,
chất lượng đề tài cũng như nguồn giống đạt được là cao nhất. Đối với công
tác nhân giống ở Việt Nam, đặc biệt với đối tượng là Song mật thì đây là vấn
đề đang được khuyến khích và triển khai trên mọi đối tượng là cây trồng sản
xuất cũng như trong bảo tồn nguồn gen thực vật trên cả nước.
15
Hình 1.1. Các bộ phận: thân, bẹ, đốt, gai, hoa, quả
của Song mật (nguồn Internet).
Hình 1.2. Ngọn và roi (flagelle) của Song mật
trong tự nhiên (nguồn Internet).
16
Chương 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
˗ Xác định mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Song mật thu thập
tại 4 tỉnh phía Bắc.
˗ Cơ sở phân tử cho công tác chọn tạo, nhân giống và bảo tồn các giống
Song mật quý, có giá trị cao trong sản xuất kinh tế.
2.2. Nội dung nghiên cứu
˗ Tách chiết ADN tổng số của các dòng Song mật ở 4 xuất xứ khác
nhau.
˗ Sử dụng kỹ thuật RAPD phân tích các mẫu ADN tổng số thu được với
20 đoạn mồi ngẫu nhiên.
˗ Xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan di truyền của Song mật
với các xuất xứ bằng phần mềm NTSYSpc version 2.02h (Applied
Biostatistics Inc., USA., 1998)
mồi
Trình tự nucleotide
1 PC01 5’-GGACTGGAGT 11 PC11 5’-AACCGACGGG
2 PC02 5’-TGCTCTGCCC 12 PC12 5’-GGGGGTCGTT
3 PC03 5’-GGTGACGCAG 13 PC13 5’-TACCACCCCG
4 PC04 5’-TGGGGGACTC 14 PC14 5’-GGCGGACTGT
5 PC05 5’-GTAGACCCGT 15 PC15 5’-CCAGACCCTG
6 PC06 5’-TTCCCCCGCT 16 PC16 5’-CAATCGCCGT
7 PC07 5’-GGACCCTTAC 17 PC17 5’-TCGGCGATAG
8 PC08 5’-TGGACCGGTG 18 PC18 5’-GTCCACACGG
9 PC09 5’-AAGCCTCGTC 19 PC19 5’-CAGCACCCAC
10 PC10 5’-ACTTCGCCAC 20 PC20 5’-GGGAAGGACA
Copyright: Tài liệu đại học ©