z



BÁO CÁO KHOA HỌC

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN
HA1 BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT
VIRUS CÚM A/H5N1 Ở THỰC VẬT



Nguyễn Huy Hoàng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 71(9): 121 - 126
121
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN HA1
BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS CÚM A/H5N1 Ở THỰC VẬT Nguyễn Huy Hoàng
1*
, Phạm Bích Ngọc

cúm A gây nên. Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên
một số loài chim mang virus gây bệnh, nhƣng không có
biểu hiện của bệnh. Đây là mối nguy hiểm lan truyền
bệnh cho các loài gia cầm khác. Ngoài ra, chúng còn là
nơi cung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên
các biến thể mới. Các biến thể virus cúm A gây bệnh
trên ngƣời đều có nguồn gốc tiến hoá biến thể và biến
chủng từ động vật và sau khi thích ứng trên ngƣời thì
gây bệnh, trƣớc đây đã tạo nên những vụ dịch thảm
khốc, rồi biến mất sau một thời gian lại tái hiện và gây
nên đại dịch mới.
Virus cúm gia cầm (avian flu) thuộc họ
Orothomyxoviridae type A là virus RNA, chứa hệ gen
là RNA âm sợi đơn (-ssRNA) bao gồm 8 phân đoạn, có
độ dài tổng số 13.500 nucleotide. Phân đoạn 1-3 mã hóa
cho protein PB1, PB2 và PA có chức năng là
enzymepolymerase, điều khiển tổng hợp ribonucleic
acid nguyên liệu cho hệ gen và RNA thông tin. Phân
đoạn 4 mã hóa cho protein hemagglutinin (HA) là
protein “độc” mang tính chất gây bệnh, có tính kháng
nguyên và có khả năng ngƣng kết với hồng cầu gà. Phân
đoạn 5 mã hóa cho nucleprotein (NP) là protein có trách
nhiệm bao bọc hệ gen. Phân đoạn 6 là gen chịu trách
nhiệm tổng hợp protein enzyme neuraminidase (NA),
cắt thụ thể giải phóng virus khỏi tế bào , sau chu kì nhân
lên của chúng. Phân đoạn 7 mã hóa cho hai tiểu phần
protein đệm M1 và M2 (matrix protein) có chức năng
tập hợp virus và tạo kênh vận chuyển ion qua màng
Vector pUC18/HA1 (HAop) của virus H5N1 đã đƣợc
tối ƣu hóa mã để biểu hiện ở thực vật. Vector chuyển
gen pK7WG2D(1). Vector pENTR221/cal nhận từ Viện
Sinh học phân tử và Dƣợc học, Trƣờng Đại học
Heidelberg, CHLB Đức. Vector chuyển gen
pPTN289/gus.
Nguyễn Huy Hoàng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 71(9): 121 - 126
122
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L. K326 đang nuôi
cấy trong điều kiện in vitro do Phòng Công nghệ Tế bào
Thực Vật-Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Phương pháp
Thiết kế vector chuyển gen thực vật
Gen HAop đƣợc nhân lên bằng PCR vớ i cặ p mồ i đặ c
hiệ u HA1_Sacl_F/HA1_HindIII_R/HA1 theo chu trình:
95
0
C / 3 phút, 30 chu kì ( 95
0
C/30 giây, 57
0
C/30
giây,72
0

mã bộ ba giúp biểu hiện mức độ cao trong các cây
trồ ng. Chúng tôi đã tạo ra sự thay đổ i mộ t số mã bộ ba
nucleotide nhƣng không làm thay đổi trì nh tƣ̣ amino
acid (Hình 1).
Gen HAop là gen có cấ u trú c tố i ƣu biể u hiệ n trong thƣ̣ c
vậ t và đƣợ c tổ ng hợ p nhân tạ o bở i công ty Geneart ,
Germany và đƣợ c ghé p nố i và o vector pUC18.

ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCAT
GCAAACAA
M E K I V L L L A I V S L V K S D Q I C I G Y H A N N
ATGGAAAAGATTGTGCTTTTGCTTGCTATTGTGTCTCTTGTGAAGTCTGATCAGATCTGCATTGGATACCAC
GCTAACAA

CTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGA
AAAGACACACA
S T E Q V D T I M E K N V T V T H A Q D I L E K T H
CTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAAAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAA
AAGACTCACA

ACGGGAAGCTCTGCGCTCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCT
CCTCGGAAAC
N G K L C A L D G V K P L I L R D C S V A G W L L G N
ACGGAAAGTTGTGCGCTCTTGATGGTGTTAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGCTT
CTTGGAAAC

CCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAAT
GACCTCTGTTA
P M C D E F I N V P E W S Y I V E K A N P V N D L C Y
CCAATGTGTGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAACCCAGTGAACG

TCTTTTGGTTCTTTGGGGAATTCACCACCCAAATGATGCTGCTGAACAGATTAAGTTGTACCAGAACCCA
ACTACTTACA

TTTCCGTTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACG
GGCAAAGTGGA
I S V G T S T L N Q R L V P R I A T R S K V N G Q S G
TTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGG
ACAATCTGGA

AGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCA
TTGCTCCGGA
R M E F F W T I L K P N D A I N F E S N G N F I A P E
AGGATGGAATTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCA
TTGCTCCAGA

ATATGCATACAAACTTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGCAACTG
CAACACCAAGT
Y A Y K L V K K G D S T I M K S E L E Y G N C N T K
GTACGCTTACAAGTTGGTGAAGAAGGGTGATAGTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTG
CAACACTAAGT

GTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATCGGGGA
ATGCCCCAAA
C Q T P M G A I N S S M P F H N I H P L T I G E C P K
GCCAAACTCCAATGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGA
GTGCCCAAAG

TATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAACGAGAGACGCGAGGA
TTATTTGGAGC
Y V K S N R L V L A T G L R N S P Q R E R R G L F G A

GACTTTCATG
D G F L D V W T Y N A E L L V L M E N E R T L D F H
AGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACAACGCTGAGTTGCTTGTGCTTATGGAAAACGAGAGGACTCTT
GATTTCCACG

ACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTA
ACGGTTGTTTC
D S N V K N L Y D K V R L Q L R D N A K E L G N G C F
ATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGATAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAAGAGCTTGGAA
ACGGTTGCTTC

GAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTATGACTACCCGCAG
TATTCAGAAGA
E F Y H K C D N E C M E S V R S G T Y D Y P Q Y S E E
GAGTTCTACCACAAGTGCGATAACGAGTGCATGGAATCTGTGAGATCTGGAACTTACGATTACCCACAGT
ACTCTGAAGA

AGCAAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATATTGTC
AATTTATTCTA
A R L K R E E I S G V K L E S I G I Y Q I L S I Y S
AGCTAGGCTTAAGAGGGAAGAGATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGTATTTACCAGATTCTTTCT
ATTTACTCTA

CAGTGGCGAGCTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTC
GTTACAATGC
T V A S S L A L A I M V A G L S L W M C S N G S L Q C
CTGTGGCTTCTTCTCTTGCTCTTGCTATTATGGTGGCTGGACTTTCTCTTTGGATGTGCTCTAACGGATCTC
TTCAGTGC

AGAATTTGCATTTAA

khoảng 978 bp, sản phẩ m cắ t vector
pK7WG2D/cal/HA1 bằ ng SacI/HindIII thu đƣợ c 4 đoạ n
gen kí ch thƣớ c khoả ng 434bp, 978 bp, 1201bp và 11159
bp kí ch thƣớ c nà y phù hợ p vớ i tính toá n theo lý thuyế t
(Hình 3). Nhƣ vậy, cấu trúc gen HA1 đã đƣợc thiết kế
thành công vào vector biểu hiện thực vật pK7WG2D.
Dòng plasmid 1 đƣợc lựa chọn cho biến nạp vào
Agrobacterium và tạo dòng rễ tơ chuyển gen.
Nguyễn Huy Hoàng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 71(9): 121 - 126
125
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hnh 2. Cắ t pENTR221/cal/HA1 bằ ng SacI/HindIII

Hnh 3. Điệ n di kiể m tra vector tá i tổ hợ p pK7WG2D/cal/HA1 bằ ng PCR (A) và cắt bởi enzyme hạn chế SacI/HindIII
(B). M: Thang chuẩ n 1 Kb; Giếng 1 - 10: mẫ u vector tá i tổ hợ p tá ch tƣ̀ cá c dò ng khuẩ n lạ c
Biế n nạ p cấ u trú c gen vi khuẩn A.rhizogens
Chúng tôi sử dụng 50-100 ng plasmid
pK7WG2D/cal/HA1 để biến nạp vào tế bào khả biến
A.rhizogenes. Sản phẩm của quá trình biến nạp đƣợc
nuôi trên môi trƣờng YMP chọn lọc có chứa 100 mg/L
Spectinomycin, ủ đĩa ở 28
o
C. Sau 2 ngày, kết quả thu
đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc trên đĩa thạch. Để chọn ra
những dòng khuẩn lạc nhƣ mong muốn (mang vector

Công nghệ sinh học. Nghiên cứu được tiến hành có sử
dụng các trang thiết bị của Phòng Thí nghiệm Trọng
điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện
Khoa học và công nghệ Việt Nam.
Nguyễn Huy Hoàng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 71(9): 121 - 126
126
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
GATCAGATCT GCATTGGATA CCACGCTAAC AACTCTACTG AGCAAGTGGA TACAATTATG GAAAAGAACG
TGACTGTTAC TCACGCTCAG GATATTCTTG AAAAGACTCA CAACGGAAAG TTGTGCGCTC TTGATGGTGT
TAAGCCACTT ATTCTTAGGG ATTGCTCTGT TGCTGGATGG CTTCTTGGAA ACCCAATGTG TGATGAGTTC
ATTAACGTGC CAGAGTGGTC TTATATTGTG GAGAAGGCTA ACCCAGTGAA CGATCTTTGC TACCCTGGTG
ATTTCAACGA TTACGAAGAG CTTAAGCACC TTCTTTCTAG GATTAACCAC TTCGAGAAGA TTCAGATTAT
TCCAAAGTCA TCTTGGTCAT CTCACGAGGC TTCTCTTGGA GTTTCTTCTG CTTGCCCATA CCAGGGAAAG
TCATCTTTCT TCAGGAACGT TGTTTGGCTT ATTAAGAAGA ACTCTACTTA CCCAACTATT AAGAGGTCTT
ACAACAACAC TAACCAGGAA GATCTTTTGG TTCTTTGGGG AATTCACCAC CCAAATGATG CTGCTGAACA
GATTAAGTTG TACCAGAACC CAACTACTTA CATTTCTGTG GGAACTTCTA CTCTTAACCA GAGGCTTGTG
CCAAGAATTG CTACTAGGTC TAAGGTGAAC GGACAATCTG GAAGGATGGA ATTCTTCTGG ACTATTCTTA
AGCCAAACGA TGCTATTAAC TTCGAGTCTA ACGGAAACTT CATTGCTCCA GAGTACGCTT ACAAGTTGGT
GAAGAAGGGT GATAGTACTA TTATGAAGTC TGAGCTTGAG TACGGAAACT GCAACACTAA GTGCCAAACT
CCAATGGGAG CTATTAACTC TTCTATGCCA TTCCACAACA TTCACCCACT TACTATTGGA GAGTGCCCAA
AGTACGTGAA GTCTAACAGG CTTGTGCTTG CTACTGGACT TAGGAACTCT CCACAGAGAG AAAGAAGG
Hình 5. Trình tự cấu trúc gen HA1
` TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Alexander, D.J. (2007), Summary of avian influenza activity in Europe, Asia, Africa, and Australasia, 2002-2006. Avian Dis, 51(1 Suppl): 161-6.

, Pham Bich Ngoc
2
, Chu Hoang Ha
2
, Chu Hoang Mau
1
1
Thai Nguyen University,
2
Institute of Biotechnology, VAST
H5N1 is a subtype of influenza A, commonly called avian flu or bird flu. H5N1 is highly transmissible between birds and so may cause
globally poultry pandemic that ruins the poultry industry. Moreover, it may also affect human health by directly contact with infected
poultry. Like all other influenza A subtypes, the H5N1 subtype is an RNA virus. It has a segmented genome of eight negative sense,
single-strands of RNA, code for 8 proteins. Among those, HA, NA and M proteins are most medically relevant as targets for antiviral
drugs and antibodies. To prevent the viral infection, the most common method is vaccination. Currently, there have been many flu A
vaccines available. However, plant-based oral vaccine is targeted by many researchers around the world because this subunit vaccine
can be eaten, easy to administer and more effective than other injection vaccines. In this study, we present the results of vector
construction to express the enfluenza A/H5N1 surface antigens in plant.
Key words: Avian influenza, gene expression, H5N1 virus, plant vaccine, RNA.


Tel: 0915 456024, Email:
Nguyễn Huy Hoàng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 71(9): 121 - 126
127
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên