TRƯỜNG ……………….
KHOA………………

BÁO CÁO TỐT NGHIỆP
Đề tài:
Thiết kế vector mang gen
HA1 mã hóa protein bề
mặt của virus H5N1
1
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………… i
LỜI CẢM ƠN ………………………………………………………………ii
MỤC LỤC …………………………………………………………………iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ……………………………………………vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ……………………………………………… vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ……………………………………………… viii
MỞ ĐẦU

Error: Reference source not found
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3
1.1. Cúm A/H5N1

3

1.1.1. Cấu tạo

3
1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ


1.4.2. Hệ vector nhị thể

Error: Reference source not found 1
2
1.4.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học
tái tổ hợp Error: Reference source not found 3
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error:
Reference source not found5
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị

Error: Reference source not found

5
2.1.1. Vật liệu Error: Reference source not found 5
2.1.2. Hóa chất Error: Reference source not found 5
2.1.3. Thiết bị Error: Reference source not found 6
2.2. Phương pháp nghiên cứu

Error: Reference source not found

6
2.2.1.

Phương pháp nhân đoạn gen HA1bằng kỹ thuật PCR Error:
Reference source not found6
2.2.2. Phương pháp ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal Error:
Reference source not found8
2.2.3. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến
E. coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt 30
2.2.4. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway 3 Error: Reference
.

47

3.2.1.

Tạo vector tái tổ hợp theo phản ứng LR

47
3.2.2. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR

. 48
3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn

48
3.3. Kết quả biến nạp pK7WG2D/cal/HA1 vào vi khuẩn A.rhizogenes

. . 49

3.4. Kiểm tra hệ thống tạo rễ tơ chuyển gen thông qua A.rhizogenes
sử dụng gen chỉ thị Gus

51

3.5. Kết quả chuyển gen HA1 vào mảnh lá thông qua A. rhizogens
để tạo các dòng rễ tơ chuyển gen HA1

53

các tiêu điểm đó và sẽ đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y và được xem là
hướng đi phù hợp với những nước đang phát triển vì mục đích chăm sóc sức
khoẻ cộng đồng như Việt Nam.
Chuyển gen mã hóa các vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể là vào các
cây trồng là nguồn thức ăn chính cho con người, động vật nuôi là một trong
những hướng đi chính hiện nay. Tuy nhiên bên cạnh đó, một xu hướng cũng
được bắt đầu quan tâm nghiên cứu và ứng dụng là sử dụng hệ thống nuôi cấy
sinh khối tế bào để sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Do tế bào thực
vật có ưu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng
sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng
hơn cả tế bào thực vật nuôi cấy in vitro không mang các mầm bệnh cho người.
Với mục đích tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine cúm
A/H5N1, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương
pháp khả thi, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế
5
vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu
chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein
vỏ của virus H5N1.
- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây
thuốc lá tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens.
3. Nội dung nghiên cứu
- Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vào
vector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp.
- Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của
virus H5N1.
- Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu trúc gen mã hóa protein
vỏ của virus H5N1 và biến nạp vào vi khuẩn A. rhizogens.
- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây

7
dấu ấn khác của virus , . Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử
NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên
có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm
nhiễm , . Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9
phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các
phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau
về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan
trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA),
hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm
và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Các subtype này gây nhiễm cho
hầu như phần lớn mọi loài sinh vật bao gồm các loài lông vũ (gà, chim và
thuỷ cầm), lợn, ngựa, chồn đất, hải cẩu, cá voi và loài người. Trên cơ sở
trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virus cúm A có 8 phân đoạn (HA,
NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên
trong vỏ virus, có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide, mã hóa cho
11 protein tương ứng của virus (hình 2).
Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen (hình trái) gồm 8 gen là 8 đoạn RNA sợi
đơn âm (-ssRNA) và mô hình (hình phải) thể virus cúm H5N1 gồm các
8
protein và các đoạn –ssRNA. (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology,
University of Cambridge).
1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ
Độc lực gây bệnh của virus cúm A
Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại:
Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc
lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn
tại trong tự nhiên .
- HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ
quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết

10
1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô
hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn
thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó
còn được gọi là virus hướng đa phủ tạng . Khả năng gây bệnh của virus
cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng
virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn
ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng
cường độc (H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ
quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người, có lẽ do tính
thích ứng thụ thể sialic của chúng , . Hầu hết các chủng virus cúm A nhân
lên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng
cường độc phân type H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm
lượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm
thực nghiệm trên chuột lang, chuột Hamster, chồn đất , .
Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn
dịch chống lại virus bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thể
không có tác dụng bảo vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do virus
cúm A luôn có sự biến đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành ở
tự nhiên, và không có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm
A . Do đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng
nguyên khác với các chủng virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít
có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới. Đây là
nguyên nhân làm cho gia cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiều
lần trong năm, và các đợt dịch cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và có
thể gây nên đại dịch cúm mới . Khả năng gây bệnh của biến chủng virus
cúm mới giảm hoặc biến mất, khi cơ thể có được đáp ứng miễn dịch đặc
11
hiệu với biến chủng đó và chúng trở nên thích nghi lây nhiễm ở loài vật

tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi
này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’-
và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp
ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào.
Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống
enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10
- 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’, sau đó được vận chuyển ra bào tương và
dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus.
Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển
gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện
tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại
nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP
của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus
gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic
acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng
thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác , .
13
Hình 1.4. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A/H5N1
trong tế bào chủ (Nguồn: />qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194)
1.2. Kháng nguyên HA
Hemagglutinin hay Haemagglutinin là glycoprotein kháng nguyên
tìm thấy trên bề mặt của virus cúm cũng như nhiều vi khuẩn và virus khác.
Nó có tác dụng gắn virus vào tế bào bị nhiễm. Tên gọi của HA bắt nguồn
từ việc protein HA có khả năng ngưng kết hồng cầu (hem: bao vây).
16 loại kháng nguyên HA khác nhau được đánh dấu từ 1 đến 16. H16
mới được phát hiện ở virus phân
lập từ mòng biển đầu đen tại Thuỵ
Điển và Na Uy năm 2005 [15]. Ba
loại protein HA đầu tiên (H1, H2
và H3) được tìm thấy phổ biến ở

trong đó HA
1
là 48.10
3
Dal và HA
2
là 29.10
3
Dal) , .
Chức năng: Cho phép nhận biết tế bào đích của động vật có xương
sống và hoàn thành quá trình nhận biết bằng cách gắn kết với thụ thể chứa
sialic acid của những tế bào này; và cho phép đưa bộ gen của virus vào tế
bào đích bằng cách hợp nhất màng endopisome của tế bào chủ với vỏ ngoài
virus .
Cơ chế hoạt động: HA gắn kết với phân tử glycoprotein trên bề mặt
của tế bào đích, dẫn đến các phân tử virus kết dính với tế bào vật chủ.
Màng tế bào sẽ bao bọc lấy virus và phần màng này sẽ tách ra hình thành
một màng mới nằm trong tế bào gọi là endosome, endosome chứa virus
được bao gói. Tế bào sau đó bắt đầu cố gắng phân giải những thành phần
15
Hình 1.5. Mô hình cấu trúc protein 3 chiều của HA
(Nguồn: />bên trong endosome bằng cách acid hoá phần bên trong nó và biến nó
thành một lysosome (thể sinh tan). Tuy nhiên, ngay khi pH trong endosome
xuống 6.0, cấu trúc vốn được gấp lại của phân tử HA trở nên không bền,
mở ra một phần và giải phóng một chuỗi peptide rất kị nước nằm trong
phân tử protein. Chuỗi fusion protein này hoạt động như một mỏ neo, gắn
vào màng của endosome và khoá lại. Sau đó, ở pH thấp hơn, phần còn lại
của HA sẽ gấp lại hình thành một cấu trúc mới, rút mỏ neo lại và kéo màng
endosome vào sát màng virus rồi hợp nhất hai màng này. Ngay lúc này, các
thành phần của virus, bao gồm RNA genome, tự do hoà vào tế bào chất .

chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng
của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây
bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến. Hàng ngàn công trình
nghiên cứu về cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng, đặc biệt trong 5
năm gần đây, trong đó có phát triển công nghệ và các loại vaccine gây
miễn dịch cho gia cầm và chuẩn bị đối phó với đại dịch có thể xảy ra ở
người.
Virus cúm A/H5N1 có 3 trong 4 tính chất cần có để tạo một đại dịch:
có khả năng lây nhiễm trên người, gần như tất cả mọi người đều chưa có
đáp ứng miễn dịch bảo vệ và virus có khả năng gây chết cao. Trong số 16
nước có người chết do cúm gia cầm, Inonesia và Việt Nam được WHO xác
định là quốc gia “điểm nóng” có thể cúm A/H5N1 có được các điều kiện
thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người.
Không giống như dịch cúm A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2002, có thể khống
chế bằng cách tiệu diệt và loại trừ loài gia cầm trong vùng dịch để cắt đứt
nguồn lây. Cúm A/H5N1 thể độc lực cao giai đoạn 2003 đến nay, với sự
17
xuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan truyền từ
Nam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới, đây vẫn là thách thức đối
với cộng đồng và cần nghiên cứu ứng dụng các phương pháp khác nhau để
khống chế sự lây truyền một cách có hiệu quả.
Theo số liệu thống kê năm 2006, virut cúm gia cầm đã làm số người
chết ở Indonesia 45 người, Trung Quốc là 8 người, Thái Lan là 3 người, và
cho đến nay, chủng A/Vietnam/1203/2004 (Viet04) là một trong những
chủng có độc tính cao nhất ở động vật có vú, như chồn và chuột.
Trước tình hình lây lan của dịch cúm A/H5N1. Trên thế giới cũng
như ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu như:
Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus
cúm A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ
những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi

chế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp
trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam .
Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ sinh học được giao
đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine
cúm A/H5N1 cho gia cầm” và “Đánh giá chất lượng vaccine phòng bệnh cúm
A/H5N1 cho gia cầm tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” trong giai đoạn
2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú y, Xí nghiệp thuốc Thú y trung ương
(VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung ương II (NAVETCO), Trung tâm
Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực hiện nghiên cứu có được vaccine
sản xuất từ chủng NIBRG-14 .
19
1.3.2. Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới
Trong tự nhiên, “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” là các hiện
tượng xảy ra liên tục theo thời gian, còn “trộn kháng nguyên” tái tổ hợp
subtype Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) thường định kỳ xảy
ra giữa các loài mắc nhằm tạo nên các biến thể virus cúm mới mà hệ miễn
dịch của cơ thể vật chủ không có khả năng nhận dạng đáp ứng và kịp hình
thành miễn dịch. H5N1 sử dụng thụ thể sialic xâm nhập tế bào .
Hemagglutinin cùng với protein enzyme neuraminidase, được xác định là
protein có vai trò kháng nguyên và độc lực và các protein kháng nguyên có
nguồn gen từ các chủng H5N1 của Việt Nam, cũng được nghiên cứu sản
xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp và sử dụng với các mục đích khác nhau, trong
đó có thử nghiệm làm kháng nguyên kích thích miễn dịch và chẩn đoán.
Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính
chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch
cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát
triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà
còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người .
Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng
nguyên trong vaccine, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều

di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ
gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi
bằng kỹ thuật gen . Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới
(WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản
xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC),
VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC). Hai chủng cúm
21
A/H5N1 cung cấp nguồn gen H5 và N1 là A/Vietnam/1194/2004(H5N1)
hoặc A/Vietnam/1203/2004(H5N1). Trung Quốc cũng là nước sản xuất
nhiều giống virus vaccine chống cúm, ví dụ, Viện Nghiên cứu Thú y
Harbin (Cáp - Nhĩ - Tân) đã thành công trong việc tạo giống vaccine vô
hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủng
A/Turkey/England/N-28/73(H5N2), loại subtype H5N2 có độc lực yếu; hay
giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N1 từ
chủng A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực yếu . Các loại
vaccine này đã được nhập và sử dụng tại Việt Nam từ năm 2006 cho đến
nay.
Vaccine thế hệ mới chủng NIBRG-14: Chủng NIBRG-14 là giống
virus vaccine nhược độc (attenuated vaccine) thế hệ mới, thuộc loại hình
vaccine được xóa gen bằng công nghệ gen (gene-deletion vaccines), được
lắp ráp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics –based
technology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà. Phương pháp
di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng virus nhân tạo nhược độc
làm vaccine, cụ thể hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG-14 này được tái tổ
hợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount
Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làm
nền, còn các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) được lấy từ chủng cúm
cường độc gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam
(A/Vietnam/1194/2004(H5N1)) . Bằng thao tác kỹ thuật gen, gen H5 đã bị
đột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng với một số đột biến điểm ở

DNA và vir (virulence). Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ
- nguồn cacbon và nito cho vi khuẩn. Ri-plasmid được chia làm hai nhóm
23
chính: agropine và mannopine và một số nhóm phụ được tìm thấy và phân
loại sau này như: cucumopine và mikimopine. Trong đó các chủng thuộc
nhóm agropine (A4, 15834, LBA9402, 1855) được chứng minh là độc hơn
so với các chủng thuộc nhóm mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủng
này được sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật , .
T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính là
vùng biên trái T
L
-DNA và biên phải T
R
-DNA. Hai vùng này đều có kích
thước khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi một đoạn DNA, đoạn DNA
này sẽ không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng T
R
-DNA
mang các gen mã hóa tổng hợp DNA (tms1 và tms2), vùng T
L
-DNA bao
gồm 18 khung đọc (ORFs) trong đó có bốn loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa
cho rol A, B, C và D (root locus). Các Ri-plasmid của các chủng
A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine và mikimopine chứa
vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống như vùng T
L
-DNA của các chủng
thuộc nhóm agropine nhưng khuyết gen rolD , .
24
Các gen rolA, rolB and rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình