MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cúm gà (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của các
loài chim, kể cả gia cầm và thuỷ cầm, do các subtype khác nhau thuộc nhóm
virus cúm A gây nên. Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên một số loài chim
mang virus gây bệnh, nhưng không có biểu hiện của bệnh. Đây là mối nguy
hiểm lan truyền bệnh cho các loài gia cầm khác. Ngoài ra, chúng còn là nơi
cung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên các subtype mới. Các
subtype virus cúm A gây bệnh trên người đều có nguồn gốc tiến hoá biến thể
và biến chủng từ động vật và sau khi thích ứng trên người thì gây bệnh, trước
đây đã tạo nên những vụ dịch thảm khốc, rồi biến mất sau một thời gian lại tái
hiện và gây nên đại dịch mới. Năm 2004 các đại dịch cúm gia cầm tại các
nước châu Á (bao gồm dịch do H5N1 gây ra tại Trung Quốc, Nhật, Nam
Triều Tiên, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Campuchia và Lào; do H7N3
(Pakistan); do H5N2 ( Đài Loan) đã gây thiệt hại hàng trăm triệu gia cầm, làm
chết hàng chục người ở Việt Nam và tại Thái Lan. Chủng H5N1 điển hình ở
châu Á có tính kháng nguyên và di truyền giống với chủng
A/Vietnam/1203/04.
Để phòng chống sự lây lan mạnh mẽ của đại dịch cúm gia cầm, hàng
năm Việt Nam cần một lượng vaccine rất lớn để tiêm chủng cho hàng trăm
triệu con gà vịt. Ngoài những công nghệ sẵn có Việt Nam đang tìm kiếm
những công nghệ sản xuất vaccine có ý nghĩa kinh tế, an toàn và hiệu quả cao.
Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng được
các tiêu điểm đó và sẽ đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y và được xem là
hướng đi phù hợp với những nước đang phát triển vì mục đích chăm sóc sức
khoẻ cộng đồng như Việt Nam.
1
Chuyển gen mã hóa các vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể là vào các
cây trồng là nguồn thức ăn chính cho con người, động vật nuôi là một trong
những hướng đi chính hiện nay. Tuy nhiên bên cạnh đó, một xu hướng cũng
được bắt đầu quan tâm nghiên cứu và ứng dụng là sử dụng hệ thống nuôi cấy

type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt vỏ của hạt
virus . Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện,
đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử
khoảng 250 triệu Dal. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa
khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là
carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc
ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand (Hình
1).
Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp
ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A. Ghi chú: A: Các dạng hình thái
3
khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình cấu tạo
hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase:
phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzyme
polymerase của virus). C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP
(Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).
Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của
virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào
nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có
khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng
10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ
virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các
dấu ấn khác của virus , . Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử
NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên
có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm
nhiễm , . Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9
phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các
phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau
về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan
trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA),

nguy hiểm , .
Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1
Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim
hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự
nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ
của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên .
Hình 1.3. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của
virus cúm A (Nguồn:
qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194)
Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm
A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như
gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả ở
người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại
loài” như gà - lợn; gà - lợn - người. Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm
khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm , , . Đặc
điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi,
6
tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên
(gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có
khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi
chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh
từ gia cầm sang người và giữa người với người , , .
1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô
hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn
thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó
còn được gọi là virus hướng đa phủ tạng . Khả năng gây bệnh của virus
cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng
virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn
ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng

nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp,
đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [49], .
Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp
của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối
cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm.
Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của
tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy
ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi
tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase. Thời gian một chu
trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng
vài giờ. Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng
các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá
8
trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật
chủ , .
Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen
của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của
virus và các RNA vận chuyển. Phức hợp protein – RNA của virus được vận
chuyển vào trong nhân tế bào .
Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi
dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng
tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi
này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’-
và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp
ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào.
Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống
enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10
- 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’, sau đó được vận chuyển ra bào tương và
dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus.
Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển

Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus
cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704
- 1707 bp). Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA -
kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA
1
và HA
2
. Vùng
nối giữa HA
1
và HA
2
gồm một
số amino acid mang tính kiềm
được mã hóa bởi một chuỗi
oligonucleotide, đó là điểm cắt của enzym protease, và đây là vùng quyết
định độc lực của virus , . Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.10
3
Dal (nếu không được glycosyl hóa) và 77.10
3
Dal (nếu được glycosyl hóa,
trong đó HA
1
là 48.10
3
Dal và HA
2
là 29.10
3
Dal) , .

Scotland vào năm 1959. Có thể gọi cúm A/H5N1 phân lập năm 1959 tại
Scotland là virus cúm A/H5N1 cổ điển (danh pháp: A-Ck-Scotland-(59)
(H5N1) (số đăng ký: X07869). Từ đó cho đến nay, H5 và N1 đã có thay đổi
lớn xét về cấu trúc thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch . Sau gần 40
năm không phát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông (1996), và
Hồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà
còn thích ứng và gây chết người bệnh. Cúm A/H5N1 giai đoạn 2003 đến
nay, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây
bệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ
12
truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1
trước đây , , .
Nhằm ngăn chặn dịch bệnh lây lan, trong hơn mười năm qua, trên thế
giới đã có hàng trăm triệu gia cầm đã bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho
ngành chăn nuôi và kinh tế. Đặc biệt, số người nhiễm và tử vong do virus
cúm A/H5N1, mỗi năm một cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúm
gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến
tháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó, 243
trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11%. Việt Nam và Indonesia là các 2
quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 trên
thế giới. Tính gây bệnh của A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở
chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng
của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây
bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến. Hàng ngàn công trình
nghiên cứu về cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng, đặc biệt trong 5
năm gần đây, trong đó có phát triển công nghệ và các loại vaccine gây
miễn dịch cho gia cầm và chuẩn bị đối phó với đại dịch có thể xảy ra ở
người.
Virus cúm A/H5N1 có 3 trong 4 tính chất cần có để tạo một đại dịch:
có khả năng lây nhiễm trên người, gần như tất cả mọi người đều chưa có

chủng thuộc dòng Quảng Đông . Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia
cầm và người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc thế hệ mới đã có biến
đổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từ
vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông. Các chủng phân lập những năm
2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ
14
phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1
vùng Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-
Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm
vùng Trung Quốc và Hồng Kông , . Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng
H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn
đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng
kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng Quảng
Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch .
Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân
biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt
các phân type HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết
hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới. Phát hiện nhanh H5N1 và các phân
type khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học
phân tử đã được xây dựng thành phương pháp . Nghiên cứu vaccine và miễn
dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạo
chế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp
trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam .
Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ sinh học được giao đề
tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine
cúm A/H5N1 cho gia cầm” và “Đánh giá chất lượng vaccine phòng bệnh cúm
A/H5N1 cho gia cầm tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” trong giai đoạn
2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú y, Xí nghiệp thuốc Thú y trung ương
(VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung ương II (NAVETCO), Trung tâm
Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực hiện nghiên cứu có được vaccine

vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như
chủng gây bệnh trên thực địa. Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous
vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống
chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng.
Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được
sản xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang
được nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:
Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus
đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus
type H5N1 và H7N1. Ví dụ, hãng Merial của Pháp sản xuất vaccine
TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83 (H5N2),
sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi.
Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và
tách chiết làm vaccine.
Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc
Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen
kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm
vaccine phòng chống virus cúm A/H5N1.
Vaccine DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA,
NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen .
Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật
di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ
gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi
bằng kỹ thuật gen . Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới
(WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản
xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC),
VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC). Hai chủng cúm
17
A/H5N1 cung cấp nguồn gen H5 và N1 là A/Vietnam/1194/2004(H5N1)
hoặc A/Vietnam/1203/2004(H5N1). Trung Quốc cũng là nước sản xuất

Agrobacterium là các loài vi khuẩn đất, thuộc nhóm Gram (-), yếm
khí, khi xâm nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn này gây ra các triệu
chứng bệnh trên thực vật như tạo khối u hay lông rễ. Agrobacterium thuộc
họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium có 4 loài chính: Agrobacterium
tumefaciens, Agrobacterium rhizogens, Agrobacterium radiobacter,
Agrobacterium rubi. Trong đó A. tunefaciens và A. rhizogenes là hai loài
được nghiên cứu nhiều nhất là vi khuẩn gây ra bệnh khối u (crown gall) và
bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm.
Tác nhân gây bệnh của hai loài vi khuẩn trên đã được xác định là do
sự có mặt của Ti (tumour inducing) ở A. tumefaciens và Ri (root-inducing)
ở A. rhizogenes . Khi tế bào thực vật bị thương, sẽ tiết ra các polyphenol
hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển đoạn T-DNA (transfer DNA) từ T-
plasmid hay R-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Nhìn chung, cơ chế
của quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-
DNA vào tế bào vật chủ của hai loài vi khuẩn này được chính minh là
tương tự nhau . Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn A. tumefaciens
do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định. Trong khi đó các gen mã hóa
sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A. rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá
trình hình thành rễ tơ ở thực vật , .
Giống như Ti-plasmid, Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi
kép, có trọng lượng phân tử lớn, từ 200 - 800 kb, gồm hai vùng chính là T-
DNA và vir (virulence). Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ
- nguồn cacbon và nito cho vi khuẩn. Ri-plasmid được chia làm hai nhóm
19
chính: agropine và mannopine và một số nhóm phụ được tìm thấy và phân
loại sau này như: cucumopine và mikimopine. Trong đó các chủng thuộc
nhóm agropine (A4, 15834, LBA9402, 1855) được chứng minh là độc hơn
so với các chủng thuộc nhóm mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủng
này được sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật , .
T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính là

trong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium và trong các thao tác
sử dụng để thiết kế gen vào các vector này. Mặt khác các enzyme giới hạn
có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi công nghệ
gen lại cần những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzyme giới
hạn. Thêm vào đó, ở A.tumefaciens, một số gen mã hóa sinh tổng hợp auxin
được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội nhưng lại cản trở quá trình
21
Hình 1.6. Cấu trúc Ri plasmid
tái sinh bình thường ở thực vật. Với các lí do trên đây, các nhà khoa học đã
cải tiến Ti-plasmid thành một hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen
(mang cấu trúc T-DNA) và vector bổ trợ (mang các gen vir) đảm nhiệm
chức năng vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật .
Vector chuyển gen trong hệ vector nhị thể ở A.tumefaciens có thể sử
dụng để chuyển gen thông qua A.rhizogenes. Khi nhiễm A.rhizogenes với
thực vật sẽ làm chuyển T-DNA từ vector chuyển gen cùng với T-DNA của
A.rhizogenes vào genome thực vật .
Sự tái sinh thành cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.rhizogenes có
thể xảy ra thông qua sự phát triển phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan từ
rễ. Tuy nhiên, thực vật tái sinh từ lông rễ thường bị biến đổi hình thái: lá bị
gấp nếp, hệ thống rễ ăn nghiêng, sinh trưởng cằn cỗi và khả năng sinh sản
kém.
22
Hình 1.7. Hình ảnh tạo khối u gây ra do A. tumefaciens (trái) và
rễ tơ do A. rhizogenes (phải).
1.4.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp
Tế bào thực vật nói chung và rễ tơ nói riêng với ưu thế nuôi cấy dễ
dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượng
sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả tế bào thực
vật không mang các mầm bệnh cho người , được xem là một trong những
xu hướng hiện nay được sử dụng để biểu hiện các dược phẩm sinh học tái

Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L. K326 đang nuôi cấy trong điều
kiện in vitro do Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật-Viện Công nghệ sinh học
cung cấp.
b. Chủng vi khuẩn:
- Chủng vi khuẩn E. coli One Shot TOP 10 (Invitrogen).
- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 (Viện Sinh học phân tử
và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức)
c. Các vector:
- HA của virus H5N1 đã được tối ưu hóa mã để biểu hiện ở thực vật do
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
- Vector chuyển gen pK7WG2D(1) (phụ lục 2)
- Vector pENTR
TM
221/cal

nhận từ Viện Sinh học phân tử và Dược học,
Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức. Vector này được thiết kế mang đoạn
signal peptide calreticulin nằm giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai
điểm cắt của enzyme giới hạn là SacI và HindIII nằm ở đầu 3’ của đoạn tín
hiệu dẫn (phụ lục 2).
- Vector chuyển gen pPTN289 mang gen gus được sử dụng để kiểm tra
qui trình chuyển gen sử dụng trong nghiên cứu (phụ lục 2)
2.1.2. Hóa chất
a) Các môi trường nuôi cấy:
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: LB, YMP.
- Môi trường nuôi cấy thực vật: WPM, MS.
Thành phần của các loại môi trường được trình bày trong phụ lục 1.
25