class="bi x0 y0 w1 h1"
ĐẠI HỌC TH I NGUY N
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
VŨ THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT
SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.)
MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN - 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
class="bi x0 y0 w1 h1"
ĐẠI HỌC TH I NGUY N
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
VŨ THỊ ANH ĐÀO
NGHI N CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT
SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.)
MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. Chu Hoàng Mậu
THÁI NGUYÊN - 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lời cam đoan
T i xin cam đoan đ y l c ng tr nh nghi n cứu của ri ng t i. C c số liệu, kết
quả nghi n cứu trong luận văn l trung thực v chưa c ai c ng bố trong một c ng tr nh
nào khác.
T c giả
Vũ Thị Anh Đào
i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

RFLP
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
Random Amplified Polymorphism DNA (Ph n t ch ADN đa h nh
được
nh n bản ngẫu nhi n)
Restriction Fragment Length Polymorphism (Sự đa h nh chiều d i c
c
phân đoạn ADN cắt hạn chế)
SDS Sodium Dodecyl Sulphat
SDS-PAGE Phương ph p điện di tr n gel polyacrylamid c chứa SDS
SSR
TBE
TAE
TE
Tris
Simple Sequence Repeats
Tris - Boric acid - EDTA
Tris - Acetate - EDTA
Tris - EDTA
Trioxymetylaminometan
NAA Naphthyl acetic acid (Axit naphthyl acetic)
iii
Số hóa bởi Trung
tâm Học liệu –
Đại học Thái
Nguyên
-
tnu.edu.vn
MỤC LỤC
Trang

2.2.3.2. X c định h m lượng proline 18
2.2.4. Phương ph p sinh học ph n tử 19
2.2.4.1. Phương ph p t ch ADN tổng số từ mầm đậu tương 19
2.2.4.2. Phản ứng RAPD 19
2.2.4.3. Ph n t ch số liệu RAPD 19
2.2.5. Phương ph p xử lý kết quả v t nh to n số liệu 20
Chƣơng 3. KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 21
3.1. Kết quả ph n t ch t nh đa dạng kiểu h nh của c c giống đậu tương nghi n cứu 21
3.1.1.Đặc điểm h nh th i, k ch thước khối lượng v h a sinh hạt của 16 giống đậu
tương 21
3.1.1.1. H nh th i, k ch thước v khối lượng hạt 21
3.1.1.2. H m lượng protein, lipit 23
3.1.2. Khả năng phản ứng của 16 giống đậu tương ở giai đoạn hạt nảy mầm 26
3.1.2.1. Kích thước rễ mầm v th n mầm 26
3.1.2.2. Hoạt độ enzym α - amilase v h m lượng đường trong hạt nảy mầm của c c
giống đậu tương dưới t c động của sorbitol 7 % 28
3.1.2.3. Hoạt độ enzym protease v h m lượng protein trong hạt nảy mầm của c c
giống đậu tương dưới t c động của sorbitol 7 % 33
3.1.2.4. Nhận x t 38
3.1.3. Khả năng phản ứng đối với hạn của 16 giống đậu tương ở giai đoạn c y non 3 l . . 39
3.1.3.1 Tỷ lệ thiệt hại 39
3.1.3.2. Chỉ số chịu hạn tương đối 41
3.1.3.3. H m lượng protein v prolin 42
3.1.3.4. Nhận x t 46
3.1.4. Sự phân bố của c c giống đậu tương nghi n cứu 46
v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3.2. Kết quả ph n t ch t nh đa dạng di truyền ở mức ph n tử ADN của c c giống đậu
tương nghi n cứu 48
3.2.1. Kết quả t ch chiết ADN tổng số 48

Bảng 3.15. Hệ số kh c nhau giữa c c giống đậu tương 46
Bảng 3.16. H m lượng v độ tinh sạch ADN của 16 giống đậu tương nghi n cứu 48
Bảng 3.17. Tổng số ph n đoạn ADN được nh n bản của 16 giống đậu tương khi ph n
t ch với 10 mồi ngẫu nhi n 50
vii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Bảng 3.18. T nh đa h nh về ph n đoạn ADN được nh n bản của 10 mồi ngẫu nhi n 51
Bảng 3.19. Th ng tin t nh đa h nh (PIC) của 16 giống đậu tương 52
Bảng 3.20. Gi trị tương quan kiểu h nh (r) 58
Bảng 3.21. Hệ số tương đồng giữa c c giống đậu tương nghi n cứu 59
viii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC C C HÌNH

Trang
Hình 3.1. Hạt của c c giống đậu tương nghi n cứu 21
Hình 3.2. Biểu đồ so s nh h m lượng protein v lipit của 16 giống đậu tương 25
Hình 3.3. H nh ảnh c y đậu tương 3 l trước khi xử lý hạn 39
Hình 3.4. Biểu đồ về tỉ lệ thiệt hại của c c giống đậu tương nghi n cứu 41
Hình 3.5. Sơ đồ quan hệ giữa c c giống đậu tương dựa tr n sự phản ứng trước t c
động của hạn 47
Hình 3.6. Kết quả điện di ADN tổng số của c c giống đậu tương tr n gel agarose 0,8%. . . . 48
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M1 53
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M8 53
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M3 54
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M5 54
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M2 55
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M4 55
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M6 56
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M9 56

diện t ch khoảng h n 74,4 triệu ha [3], [8]. Trong
đ , ch ng đ ợc trồng nhiều nhất ở
Mỹ, Braxin, Argentina, Trung Quốc, Ấn Độ.
Ở Việt Nam c y đậu t ng đ ợc gieo trồng ở cả 7 v
ng n ng nghiệp tr n cả n ớc.
C c giống đậu t ng ở n ớc ta hiện nay rất
phong ph gồm c c giống đậu t ng
nhập nội, giống lai tạo, giống đậu t ng đột biến v
tập đo n c c giống đậu t ng địa
ph ng. C c giống n y đa dạng v phong ph cả về
kiểu h nh v kiểu gen, đây là
nguồn nguy n liệu để chọn tạo giống đậu t ng mới
cho năng suất v chất l ợng phù
hợp với mục ti u chọn giống [8].
Đậu t ng l c y t ng đối mẫm cảm với
điều kiện ngoại cảnh v thuộc v o nh
m
c y chịu hạn k m. V vậy đ nh gi sự
đa dạng di truyền của c c giống đậu t
ng địa
ph ng để tạo c sở cho c ng t c lai tạo
giống v đề xuất biện ph p nâng cao tính
chịu hạn l vấn đề rất đ ợc quan t m
nghi n cứu. Hiện nay c rất nhiều ph
ng ph p
đ ợc ứng dụng trong ph n t ch sự
đa dạng di truyền của c c giống c y
trồng n i
chung v c y đậu t ng n i ri ng nh
RFLP, AFLP, SSR, RAPD C c

hình thái, hóa sinh.
- X c định h m l ợng protein, hàm l ợng đ ờng, hoạt độ enzym amylase, enzym
protease ở giai đoạn hạt nảy mầm.
- Ph n t ch sự phản ứng đối với hạn của c c giống đậu t ng trong điều kiện hạn
nh n tạo.
- Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhi n để nh n bản c c đoạn ADN từ
ADN hệ gen của c c giống đậu t ng địa ph ng.
- Thiết lập s đồ h nh c y v x c định khoảng c ch di truyền giữa c c giống đậu
t ng nghi n cứu.
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
2
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOÇ SINH HẠT ĐẬU TƢƠNG
Đậu t ng c t n khoa học l (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu
(Fabaceae), họ phụ c nh b ớm (Papilionoidace) c bộ NST 2n = 40, c nguồn gốc
từ Trung Quốc l loại c y trồng h ng năm kh ng thấy xuất hiện ở lo i hoang dại. C c
giống đậu t ng địa ph ng của n ớc ta hiện nay đ ợc du nhập từ Trung Quốc đã từ
lâu [3]. C y đậu t ng l c y trồng cạn thu hạt, gồm c c bộ phận ch nh: rễ, th n, l ,
hoa, quả v hạt. Rễ đậu t ng l rễ cọc, gồm rễ c i v c c rễ phụ, tr n rễ c nhiều nốt
sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, c khả năng cố định đạm của kh ng kh tạo
th nh đạm dễ ti u [3]. C c c ng tr nh nghi n cứu cho thấy những giống c khả năng
cộng sinh v c đủ nốt sần th ờng l m cho h m l ợng protein cao, cho n n trồng c y
đậu t ng c t c dụng cải tạo đất. Th n c y đậu t ng l th n thảo, t ph n c nh dạng
bụi, l đậu t ng l l k p với 3 l ch t, nh ng đ i khi cũng c 4-5 l ch t. Đậu t ng
l c y tự thụ phấn, hoa đậu t ng nhỏ, kh ng h ng vị, c m u t m, t m nhạt hoặc
trắng, hoa mọc từ n ch l hoặc ngọn, quả đậu t ng thuộc loại quả r p, thẳng hoặc
h i cong, c nhiều l ng khi ch n c m u v ng hoặc x m. Hạt đậu t ng kh ng c nội
nhũ m chỉ c một lớp vỏ bao quanh một ph i lớn. Hạt c h nh tr n hoặc bầu dục,
tr n d i, tr n dẹt, ovan vỏ hạt th ờng nhẵn v c m u v ng nhạt, v ng đậm, xanh,

vùng khác nhau bằng ph ng ph p truyền thống kết hợp với hiện đại sẽ đ p ứng
đ ợc y u cầu của thực tiễn đặt ra v đ cũng l chiến l ợc quan trọng về sự ph t triển
c y đậu đỗ ở n ớc ta.
1.2. NGHIÆN CỨU KHẢ NĂNG PHẢN ỨNG CỦA CÅY ĐẬU TƢƠNG ĐỐI
VỚI HẠN
1.2.1. Sự phản ứng của c y đậu tƣơng đối với hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm
C y họ đậu n i chung, c y đậu t ng n i ri ng l c y c nhu cầu về n ớc cao
h n c c loại c y kh c v l c y chịu hạn k m. Đ ch nh l do trong hạt v c y đậu
t ng c h m l ợng protein v lipit rất cao, để tổng hợp 1kg chất kh cần 500-530 kg
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
4
n ớc. Trong qu tr nh nảy mầm th nhu cầu về n ớc của đậu t ng cũng kh cao
50%, trong khi ở ng chỉ l 30%, l a l 26% [8].
Khi nghi n cứu về c c đặc t nh chịu hạn của c y đậu t ng về ph ng diện sinh l v
di truyền đã cho thấy, c c đặc t nh n y li n quan chặt chẽ đến đặc điểm ho keo của
nguy n sinh chất, đặc điểm của qu tr nh trao đổi chất. T nh chịu hạn của c y đậu
t ng mang t nh đa gen. Ch ng thể hiện ở nhiều kh a cạnh kh c nhau: nh sự ph t
triển nhanh của bộ rễ, t nh ch n sớm t ng đối cũng nh bản chất di truyền của từng
giống c khả năng sử dụng n ớc tiết kiệm trong qu tr nh sinh tr ởng v ph t triển
của c y.
Trong m i tr ờng kh hạn, c y c thể chống lại sự mất n ớc hoặc nhanh ch ng b lại
phần n ớc đã bị mất nhờ hoạt động của bộ rễ v sự điều chỉnh ASTT của tế b o.
Ngo i ra, c y c n c thể chống chịu hạn bằng những biến đổi về h nh th i nh l c
nhiều l ng, lớp cutin d y, l cuộn lại th nh ống để giảm tho t h i n ớc.
Ph n t ch th nh phần h a sinh của c c c y chịu hạn, c c nghi n cứu đều cho
rằng khi c y gặp hạn c hiện t ợng tăng l n về h m l ợng ABA, h m l ợng proline,
nồng độ ion K
+
, c c loại đ ờng, hoạt độ c c enzym, axit hữu c giảm phức hợp
CO

Bằng r t ra nhận x t, hoạt độ của enzyme α-amylase v h m l ợng đ ờng tan c mối
t ng quan thuận chặt chẽ, li n quan đến khả năng nảy mầm của hạt v sự sinh
tr ởng của mầm. Giữa c c giống c sự thay đổi về hoạt độ của enzyme α-amylase và
h m l ợng đ ờng tan kh c nhau li n quan đến khả năng phản ứng đối với hạn của
từng giống [13].
Khi nghi n cứu ở c y lúa, lạc [12], [7] c c t c giả cũng r t ra kết luận t ng tự.
Trong điều kiện thiếu n ớc, c c enzym protease sẽ hoạt động một c ch t ch cực phân
giải c c protein để tạo ra c c polypeptit ngắn tan trong m i tr ờng nội b o l m tăng
ASTT v tăng khả năng phản ứng đối với hạn.
Trần Thị Ph ng Li n (1999) khi nghi n cứu về một số giống đậu t ng c khả năng
chịu n ng hạn đã nhận x t rằng, hoạt độ enzym protease trong qu tr nh nảy mầm của
hạt ở tất cả c c giống nghi n cứu rất đa dạng, c hoạt t nh cao, c khả năng ph n giải
ho n to n protein dự trữ tạo nguy n liệu để tổng hợp protein cho c thể mới [6].
Đinh Thị Ngọc (2008) khi nghi n cứu về một số giống đậu t ng ở T y Nguy n đã
r t ra nhận x t ở giai đoạn hạt nảy mầm, trong điều kiện bổ sung sorbitol nồng độ
7%, hoạt độ của protease v h m l ợng protein tan biến đổi theo xu h ớng tăng dần
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
6
v đạt cực đại v o ng y thứ 7 bắt đầu giảm ở giai đoạn 9 ng y hạn. Hàm l ợng
protein và protease c mối t ng quan thuận. Trong giai đoạn hạt nảy mầm 1, 3, 5, 7
v 9 ng y tuổi khi kh ng xử lý bởi sorbitol hoạt độ protease v h m l ợng protein
đều thấp h n so với hoạt độ protease v h m l ợng protein trong hạt nảy mầm khi xử
lý bởi sorbitol 7%. Nh vậy, p suất thẩm thấu cao c ảnh h ởng rất r l n hoạt độ
protease [11].
Một số nghi n cứu tr n c c đối t ợng kh c nh : l a, đậu xanh, lạc cho thấy trong
điều kiện hạn sinh lý có sự gia tăng hoạt độ enzym protease và có mối t ng quan
thuận giữa h m l ợng protein v hoạt độ protease thể hiện khả năng phản ứng đối với
hạn kh c nhau giữa c c giống.
1.2.2. Sự phản ứng của c y đậu tƣơng đối với hạn ở giai đoạn c y non
Hạn t c động l n c y theo hai h ớng ch nh đ l : l m tăng nhiệt độ c y v g y

Kết quả n y cũng nhận đ ợc khi nghi n cứu ở c c đối t ợng kh c nh l a, lạc [12], [7].
1.3. SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÆN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI
TRUYỀN Ở MỨC PHÅN TỬ
1.3.1. RAPD
Kỹ thuật RAPD l kỹ thuật ph n t ch sự đa h nh chiều d i c c ph n đoạn ADN đ ợc
nh n bản nhờ c c mồi ngẫu nhi n c k ch th ớc 10bp, do hai nhóm nghiên cứu của
Williams và CS (1990) [32] và Welsh và McClelland (1991) [33] đồng thời x y
dựng. Đ y l một kỹ thuật ph t hiện chỉ thị di truyền dựa tr n phản ứng chuỗi
polymerase (PCR). Kỹ thuật RAPD l ph ng ph p t ng đối đ n giản trong đ nh
gi hệ gen thực vật, n kh ng những khắc phục đ ợc nh ợc điểm của ph ng ph p
chọn giống truyền thống m c n g p bảo tồn nguồn gen c y trồng v n ng cao hiệu
quả chọn lọc.
C c yếu tố cần thiết để tiến h nh phản ứng RAPD bao gồm: ADN khu n (DNA
template); Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đ l mồi oligonucleotit c trật tự
nucleotit ngẫu nhi n v c chiều d i khoảng 10 nucleotit, trong đ C + G chiếm h n
60%; ADN - polymerase (Taq polymerase): hoạt động của Taq polymerase phụ thuộc
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
8
vào Mg
2+
, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến t nh ADN; Bốn loại deoxyribonucleotit
triphotphat (dNTP): ATP, TTP, CTP, GTP; Ion Mg
2+
.
Phản ứng RAPD đ ợc tiến h nh qua 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn biến t nh ADN: ở
nhiệt độ 95
0
C trong khoảng 30-60 gi y l m cho hai mạch khu n ADN t ch nhau. (2)
Giai đoạn tiếp hợp mồi: khi nhiệt độ hạ xuống 32-40
0

h nh. Hiện t ợng đa h nh c c đoạn ADN đ ợc nh n bản ngẫu nhi n xuất hiện l do
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
9
c sự biến đổi tr nh tự nucleotit tại vị tr c c đoạn mồi li n kết. Sản phẩm khuếch đại
đ ợc ph n t ch bằng điện di tr n gel agarose hoặc polyacrylamide v c thể quan s t
đ ợc sau khi gel đ ợc nhuộm bằng ho chất đặc tr ng. V vậy, t nh đa h nh th ờng
đ ợc nhận ra do sự c mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nh n bản [32].
1.3.2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng RAPD
Hiện nay, kỹ thuật RAPD đã v đang đ ợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực của sinh học ph n tử. Ng ời ta đã d ng kỹ thuật n y để thiết lập bản đồ di truyền
ph n tử [29], [30], nhận dạng c c giống c y trồng, ph t hiện quan hệ ph t sinh chủng
loại đối với nhiều loại c y trồng, đ nh gi sự thay đổi genome của c c d ng chọn lọc,
đ nh gi hệ gen của giống v sự đa dạng di truyền của tập đo n giống [25], [26], [32].
Từ khi ra đời kỹ thuật RAPD đã đ ợc ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối t ợng
kh c nhau nh : đậu xanh, l a, lạc, chuối, ng , đậu t ng trong việc đ nh gi đa
dạng di truyền giữa c c lo i v trong phạm vi một lo i [16], ph n t ch v đ nh gi bộ
genome thực vật nhằm x c định những thay đổi của c c d ng chọn lọc ở mức độ
ph n tử [12].
Để đ nh gi sự thay đổi di truyền của c c d ng l a t i sinh từ m sẹo chịu
mất n ớc, Lê Xu n Đắc, Đinh Thị Ph ng đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhi n để chỉ ra
sự sai kh c ở mức độ ph n tử giữa c c đối t ợng n y [4]. Đ nh gi t nh đa dạng của
một số giống lạc trong tập đo n giống chống chịu bệnh gỉ sắt [16], với 11 đoạn mồi
ngẫu nhi n, t c giả đã nhận đ ợc 109 ph n đoạn ADN, trong đ c 66 ph n đoạn đa
h nh, chiếm 60,6%. Điều n y cho thấy, trong phạm vi của mỗi phản ứng RAPD
giữa 33 giống lạc nghi n cứu kh c nhau về cấu tr c ADN, mức sai kh c từ 4% đến
18%. Kết quả ph n t ch ADN cho thấy c c giống lạc ở c ng một v ng địa lý, sinh
th i đ ợc tập trung th nh từng nh m, giữa c c giống chống chịu bệnh gỉ sắt của tập
đo n giống ICRISAT v c c giống năng suất trong n ớc kh ng nằm trong c ng một
nh nh. V thế c thể lựa chọn c c cặp bố mẹ mong muốn để phục vụ cho công tác
lai giống. Với 10 mồi ngẫu nhi n, Nguyễn Thị T m (2004) đã cho thấy c c d ng