PHÂN LẬP CÁC CHỦNG BACILLUS
THURINGIENSIS KURSTAKI Ở VIỆT NAM

Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn,
Nguyễn Thuỳ Châu
Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạch
Đinh Duy Kháng
Phòng Vi Sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh học

Ngày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâu
hại cây trồng và nông sản bảo quản đã được khuyến khích,
ứng dụng để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học, trong
đó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt là
Bt) được dùng rộng rãi nhất. Trong những năm gần đây các
nhà khoa học đã có rất nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩn
này từ môi trường của nhiều nước trên thế giới với hy vọng
tìm ra những chủng B. thuringiensis có phổ gây bệnh mới
và khoảng vật chủ rộng hoặc nâng cao hoạt tính các chủng
B.thuringiensis đối với các nhóm côn trùng mới, hay tìm
kiếm nguồn gen từ những chủng phân lập cho các kỹ thuật
di truyền tiếp theo. Với sự phát triển mạnh mẽ của công
nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là công nghệ gen đã mở ra
những tiềm năng hết sức to lớn cho việc phát triển thuốc trừ
sâu sinh học B. thuringiensis. Việc làm giàu thêm bộ sưu
tập các chủng B. thuringiensis phân lập ở Việt Nam và
nguồn gen quý từ những chủng này nhằm tạo ra các chủng
tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng hơn đối với một số loài
côn trùng quan trọng là rất cần thiết. Chúng tôi đã tiến hành
phân lập, phân loại các chủng B. thuringiensis có hoạt tính
diệt sâu từ nguồn tự nhiên của Việt Nam, sử dụng một số
kỹ thuật sinh hoá và sinh học phân tử để xác định tính chất


I.3. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu:

Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park [10]: Đối tượng
sâu được thử là sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo
(Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera litura): lá
bắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính
3cm vào hỗn dịch bào tử tinh thể B. thuringiensis có nồng
độ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa petri và cho vào
mỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu. Đối với
sâu bông (Helicoverpa armigera) cũng được tiến hành
tương tự trên lá bông. Hoạt tính diệt sâu ngài gạo (Corrcyra
cephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạo
vào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinh
thể của B. thuringiensis với liều 5x10
7
bào tử/gam gạo, nuôi
ở 30
0
C với độ ẩm 70-80%.

I.4. Xác định tính chất 10 chủng B. thuringiensis kurstaki
phân lập.

Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể của các
chủng B. thuringiensis.
Chủng B. thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T
3

đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100.

Trong số 137 mẫu từ các nguồn khác nhau gồm: 55 mẫu
đất, 56 mẫu lá, 26 mẫu mùn thóc, đã phân lập được 36
chủng B. thuringiensis. Số chủng tinh thể có hình quả trám
là 11(chiếm 31%), số chủng có tinh thể hình khối lập
phương là 10 (chiếm 28%), số chủng tinh thể có hình
vuông và hình chữ nhật là 6 (chiếm 17%), số chủng có tinh
thể không đều đặn là 4 (chiếm 10%) số chủng có tinh thể
hình cầu là 2 (chiếm 5%) và chủng có thể vùi nhỏ là 3
(chiếm 8%). Tần suất B. thuringiensis phân bố cao nhất từ
nguồn đất là 35%, trên mùn thóc là 30% và thấp nhất ở trên
lá cây là 16%.

Chúng tôi chọn 11 chủng có tinh thể hình quả trám trên đây
để phục vụ cho các mục đích nghiên cứu tiếp theo của đề
tài.

II.2. Phân loại các chủng B. thuringiensis có tinh thể
hình quả trám bằng các phản ứng kháng huyết thanh.

Phân loại B. thuringiensis bằng phương pháp định typ
huyết thanh của Ohba và Aizawai [3]. Kết quả trong số 11
chủng B. thuringiensis phân lập có tinh thể hình quả trám
có 10 chủng thuộc loài phụ aizawai và 1 chủng thuộc loài
phụ kurstaki.

II.3. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu các chủng B.
thuringiensis phân lập.

Kết quả thử hoạt tính diệt sâu của các chủng B.
thuringiensis có tinh thể hình vuông và hình chữ nhật (dự
Kết quả thử sinh học cho thấy sâu bông là loài rất khó diệt.
Chúng tôi cho rằng cần phải có những nghiên cứu sâu hơn
về mặt sinh học phân tử đối với 6 chủng B. thuringiensis
var. kurstaki có hiệu lực diệt sâu bông nói trên như: phân
tích sự tồn tại các gen cry, tạo dòng và xác định trình tự các
gen cry mã hoá protein tinh thể độc tố có hiệu lực diệt sâu
bông, từ đó tạo ra chủng B. thuringiensis tái tổ hợp mới có
hiệu lực diệt sâu bông là rất cần thiết và có ý nghĩa thực
tiễn cho công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis
diệt trừ sâu bông H. armigera tại Việt nam.

Kết quả thử sinh học của các chủng B. thuringiensis có tinh
thể hình quả trám trên đây là những số liệu có giá trị trong
việc tìm kiếm các chủng B. thuringiensis có hoạt tính diệt
sâu cao đối với các loài sâu cánh vảy ngoài đồng như sâu
tơ, sâu keo, sâu khoang và sâu ngài gạo hại nông sản trong
kho. Những kết quả này góp phần bổ sung vào bộ sưu tập
chủng giống phục vụ cho công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu
vi sinh B. thuringiensis.

II.4. Phân tích protein tinh thể và bào tử của các chủng
B. thuringiensis var. kurstaki phân lập bằng phương
pháp điện di protein.

Hình 1. Điện di đồ protein trên gel 10% polyacrylamid
(SDS-PAGE) của các chủng
B. thuringiensis var. kurstaki phân lập và chủng chuẩn.


thuringiensis var. kurstaki phân lập và hai chủng chuẩn B.
thuringiensis var. kurstaki A1 và B. thuringiensis var.
aizawai M1.

Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1Ab
của các chủng B. thuringiensis phân lập và chủng B.
thuringiensis chuẩn.

Chú thích: Kênh (1-2): chủng chuẩn B. thuringiensi var.
aizawai M1, B. thuringiensis var. kurstaki A1; Kênh 3: chỉ
thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và EcoR I) từ trên
xuống (21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584,
1330, 983, 831, 564 bp); kênh(4-13) các chủng phân lập
theo thứ tự (47S, 50S, H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S,
H13 ).

Kết quả ở hình 3 cho thấy: sản phẩm PCR thu được rất đặc
hiệu, không có sản phẩm phụ. Ở cả 10 chủng Bt. kurstaki
phân lập có duy nhất một sản phẩm PCR đặc hiệu vào
khoảng 238 bp theo lý thuyết giống với sản phẩm PCR của
chủng Bt. kurstaki chuẩn (kênh 2, 4-13). Riêng chủng
chuẩn Bt. aizawai M1 không có sản phẩm PCR. Như vậy
10 chủng Bt. kurstaki phân lập đã mang gen cry1Ab, chủng
chuẩn Bt. var aizawai H1 không mang gen này.

Một điều rất lý thú là chủng B. thuringiensis var. kurstaki
28S mặc dù mang gen cry1Ab, nhưng lại không có hiệu lực
diệt sâu tơ và sâu keo. Theo Kalman và cs [9] thì chủng B.
thuringiensis mang gen cry1Ab có hoạt lực diệt sâu tơ rất
đặc hiệu. Chúng tôi cho rằng chủng B. thuringiensis 28S

thuringiensis var. kurstaki chuẩn (kênh 2, 3) và 10 chủng
B. thuringiensis var. kurstaki phân lập (từ kênh 5-14) đều
không có sản phẩm PCR đặc hiệu tương ứng. Như vậy cả
hai chủng B. thuringiensis var. kurstaki chuẩn và các chủng
B. thuringiensis var. kurstaki phân lập đã không mang gen
cry1C.

Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 3 và 4 cho thấy: 10
chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập ở Việt Nam
đã mang gen cry1Ab nhưng không mang gen cry1C

III. KẾT LUẬN

Đã phân lập được 36 chủng B. thuringiensis trong đó 11
chủng có tinh thể hình quả trám, 6 chủng có tinh thể hình
vuông và hình chữ nhật, 10 chủng có tinh thể hình khối lập
phương, 4 chủng có tinh thể không đều đặn, 2 chủng có
tinh thể hình cầu, 3 chủng có dạng thể vùi nhỏ.
Trên cơ sở khuôn mẫu protein thu được bằng điện di trên
gel SDS-polyacrylamid của các chủng B. thuringiensis
phân lập, có thể chia 10 chủng B. thuringiensis var.
kurstaki ra thành 4 nhóm.

Đã thử nghiệm hoạt tính diệt sâu của 10 chủng B.
thuringiensis var. kurstaki phân lập có tinh thể hình quả
trám, trong đó 9/10 chủng có hoạt tính diệt 90 - 100% đối
với sâu tơ P. xylostella và sâu keo S. exiqua; 7/10 chủng có
hiệu quả diệt 80-90% đối với sâu khoang S. litura; 6/10
chủng có hoạt tính diệt 50-60% đối với sâu bông H.
armigera. 10/10 chủng có hiệu quả diệt 100% đối với sâu

3826-3821.
7. Chau, N.T; L.H.Hieu, T.T. Binh, N. T. Lam,
N.M.Thanh, L. V. Truong, N.A Tuan. (1996), “Study on
the Bacillus thuringiensis as insecticide to control stored-
grain insects in Vietnam”, Proceeding of the second Pacific
Rim Conference on Biotechnology of Bacillus thuringiensis
and its impact to the environment, November 4-8, p. 379-
392.
8. Chau N. T; B. T. Huong, T. V. Tuan, D. T. N. Huyen, N.
D. Tien, N. N. Huyen, N. H. Ha. (2001), “Production
technology of Bacillus thuringiensis bioinsecticide in the
fermentation system 1500l and application to control
insects in vegetable, fruit and stored products”. A
manuscript sumitted to the 4 the Pacific Rim Conference on
the Biotechnology of Bacillus thuringiensis in Canberra,
Australia, 11-15 November, 2001.
9. Kalman, S., K. L Kiehne, K. J. Libs, ADN T.
Yamatomo. (1993), “Cloning of a Novel cryIC-Type Gene
from a Strain of Bacillus thuringiensis subsp–galleriae”.
Applied ADN Environmental Microbiology, p.1131-1137.
10. Maniatis, T; E.F. Fritisch, and Sambrook. (1989),
Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
11. Park S. H., B. T. Koo, B. S. Shin, S. K. Choi, Y. M.
Jeong, J. G Pan, and J. I. Kim. (1997), “Characterization of
1925 Bacillus thuringiensis isolates from plants in Korea”.
Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 25, No. 2, p.159-
165.
10 isolates having square shape crystals, 6 isolates of flat
rectangular and square crystals, 2 isolates of spherical
shape crystals and other having small inclusions. The
insecticidal activities of the spore-crystal mixture of
isolates were tested against Lepidopteran insects including:
Corrcyra cephalonica, Plutella xylostella, Spodoptera
exiqua, Spodoptera litura and Helicoverpa armigera; and
Coleopteran insects including Tribolium castaneum,
Sytophylus zeamays, and Sytophylus oryzae. The results
showed that: eleven isolates having bipyramidal shape
crystals were highly toxic to Lepidopteran insects: They
gave 100% mortality to Corrcyra cephalonica, 90-100%
mortality to Plutella xylostella and Spodoptera exiqua, 80-
90% mortality to Spodoptera litura and 50-60% mortality
to Helicoverpa armigera. They have no insecticidal
activities to above Coleopteran insects. The isolates having
square shape crystals, flat rectangular crystals, and small
inclusions have no insecticidal activities to both mentioned
Lepidopteran insects and Coleopteran insects.
Serologically of 11 mentioned isolates having bipyramidal
shape crystals, 10 isolates belong to the serovar kurstaki (H
3abc) and one belong to the serovar aizawai (H7). SDS-
PAGE of parasporal inclusions of the ten kurstaki isolates
showed two core fragments, 130 kDa and 70 kDa, and
several other minor proteins. Ten B. thuringiensis kurstaki
isolates were screened for cry1Ab and cry1C genes by PCR
method. Total DNA of these B. thuringiensis strains were
isolated then analyzed by electrophoresis on 1% agaroza
gel. The result showed that total DNA isolated was not
broken, it could be used as DNA template for the PCR.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Lê Quang Huấn.