Ứng dụng phương pháp phân tích công cụ
Phương pháp phân tích công cụ là phương pháp thuộc bộ môn của ngành hóa (Hóa
phân tích) nghiên cứu về thành phần cấu tạo và hàm lượng các thành phần của
những mẫu khảo sát. Hóa phân tích thường được chia thành Hóa phân tích định
tính và Hóa phân tích định lượng nhưng cũng hay được chia thành Hóa phân tích
vô cơ và Hóa phân tích hữu cơ.
Các phương pháp của hóa phân tích có thể được chia thành hai loại: định tính và
định lượng. Ngoài ra còn được phân loại thành các phương pháp hóa học và các
phương pháp vật lý.
Hóa phân tích thực chất là ngành phân tích đóng vai trò quan trọng trong khoa học,
kỹ thuật, trong nghiên cứu khoa học; điều tra cơ bản để phát triển tiềm năng, khai
thác tài nguyên khoáng sản; đánh giá chất lượng sản phẩm.
Sắc kí là một họ các kĩ thuật hóa phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn
hợp. Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", thường
là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di
chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ
thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian, giống
như các vận động viên chạy maratông. Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua
hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là "thời gian lưu."
Trong kĩ thuật sắc kí, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các
thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất tan khi
chúng chảy qua pha tĩnh rắn hay lỏng. Nhiều kĩ thuật khác nhau đã được dùng để
phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi
trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển
qua, như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate. Ta phân loại phương pháp sắc
ký như sau:
Sắc ký: - Sắc ký khí: + Sắc ký khí lỏng (GLC)
+ Sắc ký khí rắn (GSC)
- Sắc ký lỏng: + Sắc ký lỏng-lỏng (LLC)
+ Sắc ký lỏng-rắn (LSC)
+ Sắc ký trao đổi ion (IEC)

và định lượng)
- Co nhiều loại khac nhau tuy mục đích phân
tích: UVVIS, Huỳnh quang
5. Hệ thống ghi nhân và xử lý tín hiệu:
- Thu thập và xử lý kết quả
- Recorder, Computer + printer,
software
Hệ thống HPLC
Detector
♣ UV-Vis: detector phổ hấp thu phân tử
Xác định các chất có khả năng hấp thụ quang
♣ Huỳnh quang (Fluorescence detector): xác
định các chất có khả năng phát huỳnh quang
- Alflatoxin, Mycotoxin, Amino Acid, thuốc trừ sâu
họ Carbamate,….
♣ Đầu đo chỉ số khúc xạ (
Refractive Index Detector: RI)
♣ Đầu do độ dẫn (Conductivity detector):
Xac định cac ion vô cơ, hữu cơ
♣ Đầu do khối phổ (MS: mass spectrometry)
Xac định phần lớn các chất hữu cơ
3. Cac quá trình tách trong sắc ký lỏng
- Qua trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký
- Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc ký
- Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất
PT từ đầu cột đến cuối cột
- Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha,


TÓM TẮT
Axit hữu cơ trong lá, vỏ quả măng cụt khô được xác định bằng phương pháp
sắc ký lỏng cao áp. Lá tươi và vỏ quả măng cụt khô được chiết với nước ở
nhiệt độ 127
0
C thời gian 30-60 phút dưới áp suất 0,15 MPa. Đồng thời, vỏ
quả bứa khô được chiết bằng dung môi (axeton và metanol) trong bộ chiết
soxhlet ở nhiệt độ 75
0
C trong thời gian 8 giờ. Mẫu được bơm vào máy sắc
kí lỏng cao áp cùng với axit photphoric 0,01 M và metanol với tốc độ dòng
là 0,7 ml/phút sử dụng đetectơ 210 nm. Axit hữu cơ chủ yếu trong lá, vỏ quả
măng cụt khô được tìm thấy là axit (-) hyđroxy xitric hàm lượng lần lượt là
2,863 và 15,221 %. Phần axit còn lại trong lá, vỏ quả măng cụt là lượng nhỏ
axit xitric. Đây là kết quả đầu tiên xác định thành phần các axit hữu cơ từ
măng cụt (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.). 1. Mở đầu
Trong một vài năm gần đây, các cấu tử có khối lượng nhỏ và phức tạp được
chiết từ nhiều loài măng cụt (Garcinia Cowa, Garcinia cambogia, Garcinia indica,
Garcinia antroViridis) trong đó có axit (-)-hyđroxy xitric (HCA; 1,2-di hydroxy
propan-1,2,3 tri cacboxylic axit; hình 1), lacton của (-) axit hydroxy citric (hình 1))
có tính sinh học lý thú đã gây chú ý đối với các nhà hoá sinh các bác sỹ chuyên
khoa sức khoẻ. Đó là khả năng điều chỉnh quá trình tổng hợp axit béo, sự hình
thành lipit, sự ngon miệng, và giảm cân. Đồng
phân của (-)-HCA đã góp phần lớn trong lĩnh
vực dược học như tác nhân có vai trò quan trọng
trong mục đích giảm cân, bảo vệ tim mạch, hiệu

COOH
HO
C
CH
H
C=O
O
H×nh 1: CÊu tróc cña (-) axit hydroxy citric
vµ lacton cña (-) axit hydroxy citric
lặp lại
01 lần
10 g mẫu (cắt nhỏ) + 100 mL nước
Nồi áp suất 0,15 MPa, 30 phút
Lọc bằng vải muslin
Trộn lẫn dịch 02 lần chiết + 4g than
hoạt tính: ngâm trong nước ấm 30'
Lọc bằng giấy lọc, than hoạt tính
được rửa 02 lần với 15 mL nước và
l
ọ
c l
ạ
i nư
ớ
c r
ử
a

Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặt đến
20mL, xử lý với 100mL etanol để

L
ọ
c b
ằ
ng gi
ấ
y l
ọ
c và cô đ
ặ
c

Etanol và axeton chiêt hòa tan trong
20mL nước + 4g than hoạt tính
Ngâm trong nước ấm 30 phút và lọc
bằng giấy lọc, than hoạt tính được rửa
02 lần với 10 mL nước.
Dịch chiết góp chung thành 50 mL
(chu
ẩ
n đ
ộ
, ch
ạ
y HPLC, IR)

lặp lại
01 lần
10 g mẫu + 150 mL nước
Nồi áp suất 0,15 MPa, 60 phút

thu h
ồ
i h
ế
t axit.

T
rộn các dịch nổi, cô đặc đến thể
tích 50 mL và lưu giữ ở 4
0
C đến khi
s
ử
d
ụ
ng (chu
ẩ
n đ
ộ
, c
h
ạ
y HPLC, IR).

Nguyên liệu nghiên cứu lá, vỏ quả măng cụt được chuẩn bị theo sơ đồ ở phần
2.2.1.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Lá bứa: loại bỏ lá già, lá sâu, rửa sạch, hong khô tiến hành đo độ ẩm và thực
hiện chiết tách axit theo sơ đồ sau.

sấy.
Dựa vào các kết quả thu được, ta tính được khối lượng lá, vỏ quả Bứa trước
và sau khi sấy. Từ đó, ta tính được độ ẩm lá dựa vào công thức sau:
Trong đó: H: độ ẩm (%); m
0
: khối lượng lá hoặc vỏ quả tươi trước khi sấy
(g); m
1
: khối lượng lá hoặc vỏ quả sau khi sấy (g).
2.2.4. Phương pháp chuẩn độ [2]
Xác định hàm lượng axit tổng số trong lá, vỏ quả bứa theo tiêu chuẩn TCVN
4589-88.
Nhỏ NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền
vững.
Tính kết quả: Độ axit toàn phần theo phần trăm (X
1
) tính bằng công thức:
100
.
10
m
mm
H
−
=
P
100

2
O.
Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate (50
mg) cho vào cốc 50-mL chứa 5.0 mL nước, và xử lý với 500 mg Dowex 50 [H+].
Hỗn hợp được khuấy trong thời gian 10 phút sử dụng khấy từ. Tách lấy phần dung
dịch, và nhựa được rửa với nước có pH trung tính. Nước rửa và dung dịch dược
trộn lẫn và làm thành 25 mL, khuấy trộn, và lọc sử dụng giấy lọc. Chuẩn bị 05
dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10 ppm đến 320 ppm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit xitric cho HPLC: Dung dịch chuẩn axit
xitric được chuẩn bị riêng biệt có nồng độ từ 2 đến 30 ppm sử dụng nước cất 3 lần
cất.
HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp được sử dụng để nghiên cứu
gồm máy sắc kí lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại low pressure hãng
Knauer, và lắp cột sắc kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5µm. Bộ tổng hợp dung
môi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer. Quá trình dò được thực hiện bằng
đetectơ Knauer UV: khoảng bước sóng 190-740 nm. Pha động gồm (A) metanol
MeOH và (B) là axit photphoric 0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m. Quá trình tách
các pic tốt khi chất A trong B thay đổi từ 10-30% trong thời gian 0-25 phút, 90% A
trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn và
mẫu được lọc qua Millipore lọc 0,45 µm và tiêm vào HPLC.
Xây dựng đường chuẩn: Phương pháp xây dựng đường chuẩn được thực
hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm
mẫu dung dịch chuẩn chứa 10-320 ppm HCA tự do được tiêm vào HPLC, thao tác
rửa giải được thực hiện như phần thảo luận ở trên, và kết quả thu được các diện
tích pic. Đường cong HCA được vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ
của HCA và diện tích pic (trung bình của 03 lần chạy). Tương tự, đường chuẩn của
axit xitric được tiêm vào HPLC, được thực hiện như cách thảo luận trên, và kết quả
thu được các diện tích pic.
Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn được xác định
dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị

Khối lượng lá
sau khi sấy (g)

Khối lượng
nước trong lá
(g)
Độ ẩm
(%)
1 9.726 2.789 6.937 71.32
2 9.96 2.898 7.062 70.9
Lá
bứa
3 10.172 3.022 4.17 70.49
1 10.6012 1.6767 8.9245 84.18
2 9.7521 1.547 8.2051 84.14
Vỏ
quả
bứa
3 10.5966 1.6458 8.9508 84.47
Từ kết quả trên cho thấy độ ẩm trong lá Bứa tươi khoảng 70,70 ± 0,62 %, độ
ẩm trung bình trong lá là 70,70 %. Độ ẩm trong lá Măng cụt cao, chiếm khoảng
70% khối lượng lá. Độ ẩm trong vỏ quả măng cụt khoảng 84,31 ± 0,16 %, độ ẩm
trung bình trong vỏ quả là 84,31 %. Độ ẩm trong vỏ quả măng cụt là rất cao, chiếm
khoảng 84 % khối lượng vỏ quả.
3.2. Kết quả xác định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại (IR)
Kết quả chụp phổ IR cho thấy xuất hiện pic có bước sóng từ 3300 – 3600
cm
-1
, đó là phổ dao động của nhóm –OH có liên kết hiđro, và pic có bước sóng từ
1600 – 1800 cm

0.18
0.20
0.22
0.24
Absorbance
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Wavenumbers (cm-1)

Hình 2: Phổ IR mẫu vỏ quả bứa chiết
trong nước
Hình 3: Phổ IR mẫu lá bứa chiết trong
nước
Từ những phổ hồng ngoại trên, có thể kết luận trong mẫu chiết từ nước của
lá và vỏ quả măng cụt có sự tồn tại của axit hữu cơ có nhóm –OH.
3.3. Kết quả xác định axit hữu cơ trong lá, vỏ quả măng cụt
Bảng 2: So sánh axit hữu cơ trong lá, vỏ quả măng cụt bằng HPLC và phương
pháp chuẩn độ
Axit hữu cơ xác
định bằng HPLC
(g/100 g)

Mẫu Dung môi
chiết
HCA Axit xitric

Chuẩn độ axit-bazơ
(g/100g)
Lá bứa Nước 2,863 0 3,554
Vỏ quả bứa
khô

axit xitric chuẩn
Hình 5. Sắc kí đồ mẫu vỏ quả măng cụt
khô chiết trong metanol

Hình 6: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả măng
cụt khô chiết trong nước
Hình 7: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả măng
cụt khô chiết trong axeton

4. Kết luận
Bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) đã xác định được hàm lượng
axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa. Kết quả cho thấy axit (-) hyđroxy xitric là thành
phần axit chủ yếu có trong lá, vỏ quả bứa. Hàm lượng HCA tìm thấy trong lá, vỏ
quả bứa khô là khá cao, cụ thể HCA trong lá, vỏ quả bứa khô lần lược là 2,863 và
15,221 %.
Hình 8: S
ắ
c kí đ