Công nghệ sinh học ( phần 4 )
Dung hợp protoplast và lai vô tính tế bào thực vật
Các phương pháp lai tế bào thực vật - dung hợp tế bào trần được ứng
dụng trong tạo giống thực vật. Hiện nay có các phương pháp dung hợp tế
bào trần như sau :
1. Xử lý bằng NaNO
3

Năm 1970, Power và cs. Đã dung NaNO
3
(0,25 M) kích thích dung hợp
hai protoplast. Carlson và cs. (1972) cũng dung phương pháp này để sản
xuất cây lai đầu tiên (Nicotiana glance × N. langsdorffii). Tuy nhiên
phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO
3
không thích hợp với tế bào
bị không bào hoá mạnh như protoplast từ nhu mô lá.
2. Xử lý bằng PEG
Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylene glycol). Nồng độ và
trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm
dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (<100) không thể tạo ra một
sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu
quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với pH/Ca
2+
có hiệu quả tăng tần
số dung hợp và khả năng sống sót của protoplast. PEG có hai tác dụng:
hoặc cung cấp cầu nối để Ca
2+
có thể liên kết các bề mặt màng với nhau
hoặc dẫn đến sự rối loạn điện tích bề mặt màng trong suốt quá trình rửa
giải.

phân tử (acid nucleic, protein) thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty
thể. Nếu để các protoplast cạnh nhau, chúng có thể hòa làm một, đó là
hiện tượng dung hợp tế bào. Nếu các protoplast có nguồn gốc từ các tế
bào soma thuộc các giống, loài hoặc chi dung hợp lại thì có thể dẫn đến
hiện tượng lai tế bào soma.
Có một số phương pháp phân lập protoplast sau đây:
1. Phương pháp cơ học
Cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất cùng màng
sinh chất tách khỏi vỏ cellulose. sử dụng kim nhọn và dao phẩu tích để
cắt các mô cùng lớp vỏ, sau đó ngâm vào môi trường nuôi cấy pha loãng,
tế bào chất sẽ phồng to và tách khỏi vỏ cellulose ra ngoài, tạo thành các
protoplast tự do. Phương pháp này cho hiệu suất thấp. Sự phân lập
protoplast của thực vật bậc cao bằng phương pháp cơ học được Klercker
tiến hành đầu tiên vào năm 1892. Nói chung, các protoplast được phân
lập từ các tế bào không bào hóa cao của các mô dự trữ như chồi hành
(bulbs) và vảy hành (scales) của các loài thân hành, rễ củ cải, vỏ quả giữa
của dưa chuột và rễ củ cải đường.
2. Phương pháp sử dụng enzyme
Phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp cơ
học. Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Do
vách tế bào có thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose, nên sử
dụng enzyme pectinase, cellulase, hemicellulase để phân hủy lớp vỏ tạo
tế bào trần. Tùy theo loại mô và cây được sử dụng, người ta thay đổi
nồng độ enzyme thích hợp. Protoplast thực chất là tế bào trần không có
thành nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận
của cây (lá, rễ, hạt phấn …), callus, tế bào đơn,…
Để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy, phải bổ
sung những chất tăng áp lực vào dung dịch enzyme để duy trì thẩm thấu
giữa nội bào và môi trường bên ngoài
Phương pháp gây đa bội

ở dạng dung dịch có khả năng khuếch tán mạnh vào các mô thực vật; (ii)
Hiện tượng đa bội hoá chỉ xảy ra do tác dụng của colchicine đến những
mô đang phân chia mạnh; (iii) Khả năng cho cây đa bội tăng lên trong
những điều kiện gieo trồng tốt; (iv) Thời gian xử lý thích hợp tuỳ thuộc
vào thời gian phân bào khác nhau của các loài cây; (v) Nồng độ
colchicine được sử dụng tuỳ từng loài cây.
Phương pháp xử lý và thời gian xử lý
Colchicine là một alkaloid có ở nhiều loài thực vật, nhưng chủ yếu là ở
loài Colchicum autumnale (tập trung ở vùng Địa trung hải). Bộ phận của
đối tượng được xử lý có thể là hạt, mầm cây, chồi, nách, rễ, hoa
Colchicine rất dễ tan trong nước, ở dạng dung dịch nó khuếch tán rất
mạnh vào các mô. Trong phạm vi nồng độ từ 0,01% - 1% colchicine đều
gây hiệu quả. Nhưng nồng độ thông dụng nhất cho mọi cây trồng là
0,2%. Khi xử lý colchicine ở nồng độ cao, thời gian ngắn cho hiệu quả
hơn khi xử lý nồng độ thấp, thời gian dài. Thời gian xử lý có thể thay đổi
từ vài giờ cho đến vài ngày hoặc hơn. Tuy nhiên, nếu thời gian xử lý quá
ngắn thì hiệu quả rất thấp. Theo Dermen, nếu thêm vào dung dịch
colchicine một vài giọt glycerin thì hiệu quả có thể tăng.
 Kỹ thuật xử lý
Xử lý hạt hay mầm: Phương pháp xử lý hạt áp dụng cho nhiều loại cây có
hạt nhỏ và dễ nảy mầm. Nồng độ thích hợp nhất là 0,1% và 0,2%, xử lý
từ 3 giờ đến vài ngày hoặc hơn. Trong một giới hạn nhất định khi nhiệt
độ tăng thì hiệu quả tác dụng của colchicine tăng. Đơn giản nhất là ngâm
hạt khô vào trong dung dịch colchicine hay đặt trên lớp giấy thấm có tẩm
colchicine. Đối với hạt to và khó nảy mầm, nếu xử lý trực tiếp hạt khô
vào colchicine thì hiệu quả rất kém, mà trước đó phải ngâm hạt bằng
nước.
Phương pháp xử lý mầm cho hiệu quả cao nhất. Phương pháp chung la
ngâm hạt đang nảy mầm vào dung dịch vào dung dịch xử lý. Với từng
loại cây thời gian và nồng độ xử lý mầm thích hợp có khác nhau. Ở