MỤC LỤC
Tran
g

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt trong luận án
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………… ….1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. CÂY THÔNG ĐỎ
3
1.1.1. Tên khoa học . 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 3
1.1.3. Thành phần hóa học 5
1.1.4. Tác dụng sinh học 9
1.1.5. Các thuốc điều trị ung thư nguồn gốc từ thông đỏ 9
1.2. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT
11
1.2.1. Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai 11
1.2.2. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 13
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt
chất trong nuôi cấy tế bào thực vật 15
1.3.1. Nhu cầu nguồn nguyên liệu paclitaxel trong điều trị ung thư 21
1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật 22
1.3.3. Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫ
n chất sử dụng trong
đánh giá chất lượng sinh khối tế bào thông đỏ 28

QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ 104
4.1.1. Về nuôi cấy tạo callus thông đỏ 104
4.1.2. Về duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch 108
4.1.3. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng 111
4.1.4. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bioreactor 5 lít 124
4.1.5. Về quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ 126
4.2.
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN
LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO
THÔNG ĐỎ
126
4.2.1. Về nghiên cứu thành phần hóa học 126
4.2.2. Về chiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất chính có trong sinh
khối tế bào thông đỏ 129
4.2.3. Về chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ130
4.2.4. Về kết quả xây dựng TCCS của sinh khối tế bào thông đỏ 133
KẾT LUẬN 135
KIẾN NGHỊ 137
CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 138
TÀI LIỆU THAM KHẢO 139
PHẦN PHỤ LỤC 155

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt Chú thích
10-DAB 10-deacetylbaccatin III
2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid
2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
ACN Acetonitril
B5 Môi trường Gamborg

SH Môi trường Hildebrandt
SKLM Sắc ký lớp mỏng
SKTB Sinh khối tế bào
Tc Taxuyunnanine C
TCCS Tiêu chuẩn cơ sở
USP United States Pharmacopeia (Dược điển Mỹ)
Xyl Xylosyl

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bản
g
Tên bảng Trang
3.1 Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn 42
3.2 Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn. 43
3.3 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy 44
3.4 Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy 45
3.5 Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus 45
3.6 Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển
của callus
47
3.7 Ảnh hưởng của nồ
ng độ NAA tới sự phát triển callus 47
3.8 Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus 48
3.9 Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH 50
3.10 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus 51
3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào 51
3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus 52
3.13 Ảnh h
ưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào 53
3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế

phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào

62
3.25 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose 63
3.26 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường
64
3.27 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít
65
3.28 Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel
trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ
67
3.29 Khảo sát điều kiện pha động
71
3.30 Chương trình chạy sắc ký
73
3.31 Độ lặp lại của hệ thống
74
3.32 Sự phụ của diện tích píc vào nồng độ paclitaxel và baccatin III
75
3.33 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của paclitaxel 76
3.34 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của baccatin III
76
3.35 Kết quả xác định độ chính xác
77
3.36 Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III
78
3.37 Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu thử
78
3.38 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ
79

3.51 Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ 98
3.52 Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh kh
ối thông
đỏ
98
3.53 Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế
bào thông đỏ
99

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Trang
1.1 Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) 4
1.2 Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ 5
1.3 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 14
1.4 Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian 19
1.5 Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel 23
2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định
tính
37
3.1 Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus 43
3.2 Callus trên các môi trường khác nhau 45
3.3 Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thờ
i gian 46
3.4 Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau 49
3.5 Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch
SH
49
3.6 Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển 53
3.7 Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 54
3.8 Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong

3.5. Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus 45
3.6. Ảnh hưởng của lo
ại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển của callus 47
3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus 47
3.8. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus 48
3.9. Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH 50
3.10. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus 51
3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến t
ốc độ phát triển tế bào 51
3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus 52
3.13: Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào 53
3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế bào 55
3.15. Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển c
ủa tế bào thông đỏ 55
3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ 56
3.17. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát triển tế bào 57
3.18. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào 57
3.19. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào. 58
3.20.
Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào. 59
3.21. Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng
paclitaxel trong tế bào 60
3.22. Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng
paclitaxel trong tế bào
60
3.23. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển
tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào 61
3.24. Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát
triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào 62
3.25. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose 63

paclitaxel 91
3.46. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và hiệu
suất tinh chế paclitaxel 92
3.47. Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1 93
3.48. Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2 94
3.49. Kết qu
ả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các giai đoạn
chiết xuất, tinh chế 95
3.50. Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ 97
3.51. Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ 98
3.52. Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông đỏ 98
3.53. Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào
thông đỏ 99

1

DANH MỤC CÁC HÌNH
1.1. Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) 4
1.2. Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ 5
1.3. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 14
1.4. Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian 19
1.5. Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel 23
2.1. Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định tính 37
3.1. Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus 43
3.2. Callus trên các môi trường khác nhau 45
3.3. Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian 46
3.4. Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau 49
3.5. Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch SH 49
3.6. Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển 53
3.7. Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 54

yếu tại khu vực dãy núi Hymalaya. Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại
các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và Thành phố Đà Lạt tỉnh
Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến 1.700 m với số lượng cá thể nhỏ. Từ
lâu, trong dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn, viêm phế
quản, nấ
c, tiêu hoá ; cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc
của thân non dùng trị bệnh đau đầu Đặc biệt, trong thông đỏ có thể tìm
thấy các hoạt chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư như: paclitaxel (taxol),
cephalomannin hoặc các chất có thể bán tổng hợp ra các thuốc điều trị ung
thư như baccatin III, 10-deacetyl baccatin III, deacetyl taxol…. Tuy nhiên,
thông đỏ là loài cây sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong
cây thấp. Theo tính toán của các nhà khoa học, để đ
iều trị khỏi cho một
bệnh nhân cần sử dụng nguồn dược liệu tương đương với 8 cây thông đỏ 60
năm tuổi [125]. Vì vậy, nguồn nguyên liệu từ cây tự nhiên khó đáp ứng đủ
nhu cầu điều trị ngày càng tăng, đồng thời việc khai thác từ cây tự nhiên dẫn
đến cạn kiệt và có nguy cơ tiệt chủng loại dược liệu quý hiếm này [125].
Ở Việt Nam, các nhà khoa họ
c đã nhân giống thành công và trồng
rộng rãi thông đỏ tại Đà Lạt để lấy lá sử dụng chiết xuất 10-deacetyl
baccatin III làm nguyên liệu bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]. Hiện
nay, Bộ Khoa học Công nghệ đã cho phép triển khai nhiều đề tài, dự án về
nghiên cứu chiết xuất phân lập cũng như sản xuất thuốc tiêm paclitaxel từ
nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam nhằm mục đích tạo ra sả
n phẩm thuốc
điều trị ung thư phục vụ cộng đồng. Bên cạnh đó việc ứng dụng công nghệ
sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các hoạt chất từ dược liệu nói chung và
thông đỏ nói riêng cũng là hướng nghiên cứu mới có triển vọng [125].

2

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY THÔNG ĐỎ
Cây thông đỏ (Taxus sp.) hay cây thủy tùng được phân bố khắp các
vùng ôn đới của Bắc bán cầu, có tuổi đời kéo dài hàng trăm năm. Có nhiều
loài thông đỏ trên thế giới trong đó 8 loài được ghi nhận bao gồm: thông đỏ
Châu Âu (T. baccata); thông đỏ Thái Bình Dương (T. brevifolia); thông đỏ
Canada (T. canadensis); thông đỏ Trung Quốc (T. chinensis), thông đỏ Nhật
Bản (T. cuspidata), thông đỏ Florida – Hoa Kỳ (T. floridana); thông đỏ
Mexico (T. globosa) và thông đỏ Himalaya (T. wallichiana) – loài thấy có ở
cao nguyên Đà Lạt – Lâm Đồng của nước ta. Ngoài ra, còn có hai giống lai
được công nhận: Taxus × media = T. baccata × T. cuspidata và Taxus ×
hunnewelliana = T. cuspidata × T. canadensis.
Tại Việt Nam chủ yếu là loài thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiana
Zucc.) phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và thành
phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng (hình 1.1). Ngoài ra tại các vùng Sapa – Lào Cai,
Mai Châu – Hoà Bình, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Ba Vì – Hà Nội, Sìn Hồ - Lai
Châu còn có thêm loài thông đỏ Trung Quốc (T. chinensis) [1]. Trong luận án
này đề c
ập tới loài thông đỏ Hymalaya (Taxus wallichiana Zucc.) mọc ở Đà
Lạt được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu tạo sinh khối tế bào.

1.1.1. Tên khoa học: Taxus wallichiana Zucc., thuộc họ Thông đỏ-Taxaceae.
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Thông đỏ (thông đỏ lá dài, thông đỏ nam, hồng đậu sam) là cây bụi hay
cây thân gỗ nhỏ nhiều cành, lá thường xanh, sắp xếp theo hình xoắn ốc,
thường vặn xoắn tại gốc lá tạo thành kiểu 2 hàng. Các lá có dạng thẳng hay
hình mũi mác, với dải khí khổng màu lục nhạt hay trắng ở mặt dưới. Các loài
phần lớn là đơ
n tính khác gốc, ít khi đơn tính cùng gốc. Các nón đực dài

giống thành công bằng công nghệ nuôi cây mô và giâm cành. Kết quả đã phát
triển được hàng chục hecta thông đỏ để thu hái lá dùng trong chiết xuất 10-
DAB và các dẫn chất khác để bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]. Tuy
Photo by: Vu Binh Duong

5

nhiên, thông đỏ vẫn là những cây đã được đưa vào sách đỏ thế giới và sách đỏ
Việt Nam để lưu ý bảo vệ [3].
1.1.3. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chủ yếu từ lá, vỏ thân và cành của loài T.
wallichiana đã được nghiên cứu từ hơn một trăm năm nay bao gồm các nhóm
hoạt chất sau: alcaloid hoặc diterpenoid khung taxan, steroid, lignan,
biflavonoid và các dẫn xuất của đường [82], [136].
1.1.3.1. Các hợp chất vòng taxan diterpenoid
Các hợ
p chất diterpenoid khung taxan (hình 1.2) là thành phần tiêu biểu
quan trọng nhất tạo nên hoạt tính của cây thông đỏ.

19
20
18
17
16
15
14
13
12
11
10

O
H

19
20
18
17
16
15
14
13
12 11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1

Khung 6-10-6 Khung 6-12
Hình 1.2. Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ
* Nguồn: Li C. và cs (2008) [82]
Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được trên 50 chất diterpenoid
khung taxan trong loài Taxus wallichiana Zucc. [6]. Trong đó nhiều chất quen
thuộc có trong các loài khác thuộc chi Taxus như: paclitaxel (5), baccatin III
(1), 10-deacetyl baccatin III (3). Khung taxan diterpenoid là một khung gồm 20

R
4
R
5
TLTK
Baccatin III (1) OH H OAc OH OH [145]
19-Hydroxybaccatin III (2) OH OH OAc OH OH [95]
10-Deacetylbaccatin III (3) OH H OH OH OH [145]

Các hợp chất baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 19-hydroxybaccatin
III có nhiều trong lá thông đỏ. Đặc biệt, trong đó 10-deacetyl baccatin III có
hàm lượng khoảng 0,01 - 0,15% là nguồn nguyên liệu quý dùng để bán tổng
hợp paclitaxel và docetaxel [6].
R
2
HO
R
4
O
Ph
O
O
HO
NH
R
3
OAc
R
1
O

1.1.3.2. Các chất khác
* Các terpenoid khác
Ngoài các taxan diterpenoid, trong thông đỏ còn có các terpenoid khác
như: rhodoxathin (11), vomifoliol (12), dehydrovomifoliol (13) và
deglycosylicariside B
4
(14) [20], [104].
O
O
11

HO
OH
O
O
O
OH
13
12
OH
O
OH
14

* Lignan
Lignan là những hợp chất tiêu biểu của các loài thuộc chi Taxus nói
chung và loài T. wallichiana nói riêng, hầu hết các loài thông đỏ đều chứa các
lignan như: secoisolariciresinol (15), isotaxiresinol (16) và isolariciresinol
(17)… [49]. Trong nghiên cứu in vitro đã cho thấy rằng larciresinol và
isolarciresinol có tác dụng ức chế mạnh yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và

(19)… [39], [115], [117].

O
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
18
O
O
O
O
O
O
O
HO
OH
OH
19

* Các steroid
Các hợp chất steroid quen thuộc cũng được phát hiện trong loài T.
wallichiana như: β-sitosterol (20), stigmasterol (21)… mà hoạt tính của các
chất này đã được biết đến[20], [115], [142], [145].


[136] từ loài thông đỏ Thái Bình Dương (T. brevifolia), sau đó chúng được
xác định cấu trúc hóa học và được đưa vào sử dụng đầu tiên trong điều trị ung
thư vào năm 1992 dưới tên biệt dược là Taxol.
* Cơ chế tác dụng chống ung thư của paclitaxel
Paclitaxel ức chế sự phân rã mạng lưới vi thể của thoi nhiễm sắc; nó
kích thích quá trình ghép các dimer của vi ống thành mạng lưới vi thể và ổn
định mạng lưới vi thể bằ
ng cách ngăn chặn quá trình tháo xoắn của chúng.
Tính ổn định này ức chế sự tái tổ chức năng lượng bình thường của mạng lưới
vi thể, một hiện tượng chủ yếu của chức năng sống của tế bào trong kỳ trung
gian của quá trình phân bào, làm cho tế bào không phân chia và nhân lên
được. Ngoài ra, paclitaxel còn gây ra sự hình thành không bình thường các bó
của mạng lưới vi thể trong suốt chu kỳ của tế bào và tổ chức quá trình phân
chia thể sao của m
ạng lưới vi thể trong quá trình nhân đôi [79], [139].

10

* Chỉ định [2]
- Điều trị ung thư buồng trứng tiến triển (> 1 cm) sau phẫu thuật. Ngoài
ra còn dùng trong điều trị ung thư buồng trứng đã di căn.
- Điều trị ung thư vú giai đoạn sớm, ung thư vú đã di căn.
- Điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ ở giai đoạn không thể
phẫu thuật hoặc xạ tr
ị. Ngoài ra, paclitaxel còn dùng để điều trị ung thư
Kaposi có liên quan đến bệnh AIDS.
* Chống chỉ định
- Chống chỉ định paclitaxel cho những bệnh nhân đã có phản ứng quá
mẫn cảm nặng với paclitaxel.
- Không được điều trị bằng paclitaxel ở những bệnh nhân có số lượng