TÁI LẬP TRÌNH NHÂN BẰNG CÁC
NHÂN TỐ XÁC ĐỊNH
NHẰM TẠO TẾ BÀO PLURIPOTENT
Thực hiện: Bùi Thanh Long.
Lớp: ĐVH – K17
Giáo viên giảng dạy: TS. Trần Quốc Dung.
CẤU TRÚC BÀI BÁO CÁO
PHẦN I. MỞ ĐẦU
PHÂN II. NỘI DUNG
1. Các nhân tố xác định
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent
3. So sánh phương pháp sử dụng nhân tố xác định với các
phương pháp khác.
PHẦN III. KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN I: MỞ ĐẦU
Tế bào gốc phôi hứa hẹn là nguồn cung cấp tế bào cho các liệu
pháp cấy ghép tế bào, có thể trong tương lai được sử dụng để
điều trị các bệnh khác nhau và thương tích. Tuy nhiên, như
trong trường hợp cấy ghép nội tạng, từ chối miễn dịch sau khi
cấy ghép là một vấn đề vướng mắc với loại trị liệu này. Hơn
nữa, việc sử dụng các phôi người hiện nay gặp phải những khó
khăn nghiêm trọng về mặt đạo đức. Những vấn đề này có thể
được khắc phục nếu tế bào pluripotent được tạo ra từ các tế bào
soma của bệnh nhân. Có 3 phương pháp khác nhau nhằm tạo tế
bào pluripotent từ tế bào cơ thể là: phương pháp chuyển nhân,
phương pháp dung hợp tế bào và phương pháp tái lập trình
nhân bằng các nhân tố xác định. Trong phạm vi của bài tiểu
luận này chỉ xin đề cập đến phương pháp thứ 3: Phương pháp
tái lập trình bằng các nhân tố xác định.
PHẦN I: MỞ ĐẦU

có trong các tế bào ES, phôi sớm, các tế bào mầm và tế bào gốc thần
kinh. Vô hiệu hóa Sox2, phôi sẽ chết ở giai đoạn phát triển ngoại bì
nguyên thủy (Avilion et al 2003). Hợp tử có thể phát triển thành phôi
nang với hình thái bình thường, nhưng các tế bào chưa phân hóa không
tăng lên khi phôi nang được nuôi cấy in vitro, và chỉ có lớp dưỡng bào
và nội bì nguyên thủy được tạo ra. Phá vỡ Sox2 ở các tế bào ES chuột
bằng cách loại trực tiếp có điều kiện hoặc RNAi dẫn đến sự biệt hóa rất
nhanh (Ivanova et al. 2006; Masui et al 2007). Những dữ liệu này
chứng minh rằng Sox2 là không thể thiếu đối với việc duy trì khả năng
tạo ra tế bào pluripotent trong cả phôi sớm và các tế bào ES. Một
protein thuộc nhóm Sox khác, Sox15, cũng có hàm lượng cao trong các
tế bào ES, nhưng vai trò của nó vẫn chưa được đánh giá rõ ràng
(Maruyama et al 2005).
Phần II: Nội dung
1.3. Nanog
Nanog là một protein homeobox, đặc biệt có mặt trong các tế bào
pluripotent và bên trong khối tế bào của phôi giai đoạn phôi nang
(Chambers et al 2003; Mitsui et al 2003). Vô hiệu hóa Nanog
phôi bị phá vỡ các tổ chức mô ngoài phôi tại E5.5, không thể thấy
rõ lá mặt hoặc ngoại bì nguyên thủy (Mitsui et al 2003). Thiếu
Nanog phôi nang vẫn có hình thái bình thường, nhưng khối nội
bào chỉ tạo ra các tế bào nội bì đỉnh và không có các tế bào có
nguồn gốc từ ngoại bì khi phôi nang được nuôi cấy in vitro. Tế
bào ES có thể thiếu Nanog, nhưng chúng có xu hướng biệt hóa
thành dòng nội bì ngoài phôi ngay cả khi có mặt của LIF (yếu tố
ức chế bệnh bạch cầu). Một nhóm khác báo cáo rằng ngay cả với
dị hợp tử Nanog cũng làm cho các tế bào ES không ổn định, dễ
bị tổn thương và tự động phân hóa (Hatano et al. 2005).
Phần II: Nội dung
RNAi-mediated loại bỏ Nanog đã dẫn tới sự biệt hóa đối với cả tế

Phần II. Nội dung
1.5. Klf4
Klf4 là một nhân tố phiên mã Kruppel-like (còn được gọi nhân tố gut-
enriched Kruppel-like, GKLF) (Rowland et al 2005). Ban đầu được xác
định là một nhân tố ức chế khối u trong các bệnh ung thư đường tiêu hóa
(Zhao et al. 2004; Wei et al, 2005). Một mô hình loại bỏ có điều kiện có vai
trò hỗ trợ cho Klf4 trong bệnh ung thư đường tiêu hóa (Katz et al 2005).
Tuy nhiên, Klf4 biểu hiện quá nhanh trong ung thư tế bào biểu bì hình vảy
và bệnh ung thư vú (Foster et al 1999, 2000). Hơn nữa, sự cảm ứng của
Klf4 trong keratinocytes là cơ sở ngăn chặn sự chuyển đổi giữa 2 quá trình
phân chia và biệt hóa và bắt đầu chứng loạn sản tế bào biểu bì hình vảy
(Foster et al, 2005). Vì vậy, Klf4 được kết hợp với việc ức chế khối u và sự
phát sinh ung thư. Biểu hiện lạc vị trí của Klf4 ngăn cản sự tăng nhanh số
lượng tế bào, nhưng nếu chỉ cắt bỏ một trong các gen đích của nó, p21, là đủ
để trung hòa hiệu ứng kìm hãm tế bào của Klf4. Trong tế bào đã loại bỏ p21,
Klf4 tiến hành sự gia tăng tế bào bằng cách điều hòa p53
(Rowland et al 2005). Điều này có thể là một lý do giải thích cho chức năng
kép của Klf4 trong các bệnh ung thư.
Ngoài những biểu hiện của nó được biết đến ở đường tiêu hóa,
tinh hoàn và da, người ta còn tìm thấy Klf4 biểu hiện cao trong
các tế bào ES chuột chưa biệt hóa (Tokuzawa et al 2004). Người
ta cũng đã thấy STAT3 bất hoạt trong tế bào ES chuột làm giảm
một cách đột ngột sự biểu hiện của Klf4 và sự kìm hãm biểu hiện
của Klf4 cho phép sự tự đổi mới không phụ thuộc vào LIF
(Tokuzawa et al 2004). Một kết quả nghiên cứu khác cũng cho
biết hiệu quả tích cực của Klf4 trong sự tự đổi mới của các tế bào
ES chuột (Li et al 2005), và Klf4 đã được biết đến như là một yếu
tố kết hợp với Oct3/4 và Sox2 để kích hoạt lõi promoter Lefty1
(Nakatake et al. 2.006).
Phần II. Nội dung

bằng vector
retrovirus và nuôi cấy chúng trong tế bào ES với môi trường có
chứa G418. Với bất cứ yếu tố đơn lẻ nào, cũng không thu được
khuẩn lạc kháng G418. Tuy nhiên, bằng cách kết hợp bốn yếu tố
(Oct3/4, Sox2, c-Myc và Klf4), họ đã thu được nhiều khuẩn lạc
kháng G418. Các tế bào này giống như các tế bào ES cả về hình
thái và khả năng phân chia. Hơn nữa, khi cấy vào tế bào trần của
chuột, các tế bào gốc pluripotent (iPS) được tạo ra có chứa mô sẹo
của tất cả ba lá mầm. Do đó, các tế bào pluripotent có thể được tạo
ra từ nguyên bào sợi chỉ bằng việc sử dụng một vài yếu tố xác định
(Takahashi & Yamanaka 2006).
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
Các tế bào iPS với lựa chọn Fbx15 không góp phần tạo ra dòng
mầm hoặc trưởng thành, cho thấy sự tái lập trình của chúng chỉ xảy
ra cục bộ. Gần đây, Các nhóm nghiên cứu báo cáo rằng đã cải
thiện đáng kể chất lượng của các tế bào iPS (Maherali et al. 2007;
Okita et al. 2007; Wernig et al 2007). Cả ba nhóm nghiên cứu đều
sử dụng bốn yếu tố như nhau, nhưng Nanog được sử dụng như là
một yếu tố chỉ thị. Các tế bào iPS với lựa chọn Nanog cho thấy
nhiều mẫu gen đã biểu hiện tương tự như trong các tế bào ES hơn
khi lựa chọn Fbx15. Các tế bào iPS được cải thiện này cũng đã góp
phần tạo ra dòng mầm và trưởng thành. Những dữ liệu này cho
thấy nếu kết hợp chính xác bốn yếu tố thì có thể tạo ra các tế bào
pluripotent không hề khác biệt so với các tế bào ES.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
Sử dụng bốn yếu tố nào để tạo ra tế bào pluripotent vẫn là một câu hỏi

thể thành công với bốn yếu tố là: Oct4, Sox2, c-Myc và Klf4. Xem xét sự có mặt
không đúng chỗ của c-Myc là nguyên nhân gây ra khối u ở thế hệ con cháu thứ
2 và bản thân các retrovirus có thể xen vào các gen gây đột biến, các thế hệ của
tế bào iPS được tạo ra với một số lượng tối thiểu của các yếu tố có thể đẩy
nhanh các ứng dụng lâm sàng của phương pháp này. Người ta đã nhận thấy rằng
tế bào gốc thần kinh trưởng thành ở chuột thể hiện mức Sox2 và c-Myc nội sinh
cao hơn tế bào gốc phôi, và Oct4 ngoại sinh cùng với Klf4 hoặc c-Myc là đủ để
tạo ra các tế bào iPS từ tế bào gốc thần kinh. Những tế bào iPS được tạo ra từ
hai yếu tố tương tự như tế bào gốc phôi ở mức độ phân tử, đã góp phần vào việc
phát triển của dòng mầm, và các mẫu biến dị. Cá nhà khoa học đề xuất rằng,
trong việc tạo ra tế bào iPS, số yếu tố tái lập trình có thể được giảm xuống khi
sử dụng các tế bào soma với mức độ biểu hiện nội sinh của các yếu tố được bổ
sung phù hợp.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Các tế bào soma của chuột và người có thể được lập trình lại thành tế bào
iPS thông qua sự biểu hiện của một tập hợp các yếu tố xác định (Oct4,
Sox2, c-Myc và Klf4, cũng như Nanog và LIN28 của người). Có thể tạo
ra các tế bào iPS từ nguyên bào sợi của chuột và người khi không có c-
Myc của retrovirus, và do đó có ý kiến cho rằng biểu hiện nội sinh của c-
Myc có thể có một vai trò trong quá trình tái lập trình. Tế bào gốc thần
kinh (NSC) biểu hiện Sox2 nội sinh, có thể có chức năng trong việc duy
trì tính đa năng của NSCs, và Sox2 đã được đề xuất trong việc duy trì tế
bào pluripotent bằng cách điều hòa sự biểu hiện của Oct4. NSCs đã được
tạo ra từ việc chuyển gen Oct4-GFP (OG2)/ROSA26 của heterozygous ở
não chuột trưởng thành, protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP)
được biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter Oct4 (Oct4-GFP) và
chuyển gen lacZ của Escherichia coli từ locus ROSA26 (ROSA26 lacZ).
Các NSCs được tạo ra có khả năng tự đổi mới và có tính đa năng.

lượng tế bào.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Tương tự, sản phẩm c-Myc của gen theimmortalizing, khi kết hợp
với RAS đột biến đã bộc lộ hiệu ứng gây ung thư. Nó đã được báo
cáo rằng c-Myc làm tăng hoạt động của telomerase ở NSCs, một cơ
chế có thể chịu trách nhiệm về tính bất diệt của NSCs. Bởi vì c-
Myc làm tăng tình trạng nổi khối u trong Chimaera pups, các
nghiên cứu gần đây chứng minh rằng các thế hệ tế bào iPS không
có c-Myc của retrovirus là một phát hiện đáng kể. Điều quan trọng
là việc các tế bào iPS được tạo ra từ NSCs với Oct4 và Klf4 và
không có c-Myc đưa chúng ta đến gần hơn các thế hệ của các tế
bào iPS phù hợp cho việc cấy ghép.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
Nhóm nghiên cứu đã so sánh giữa tế bào iPS hai yếu tố OK với các
tế bào iPS bốn yếu tố và ESCs. Vào ngày 14 sau khi gây nhiễm,
năm nhóm tế bào GFP1 được tách ra và nhân giống trong điều kiện
nuôi cấy ESC, ba dòng tế bào iPS hai yếu tố OK (60%) (B-2, D-7
và F-4) có hình thái không thể phân biệt với ESCs. Không có nhóm
nào hình thành từ NSCs gây nhiễm với việc điều khiển virus (MX).
Các nhà khoa học đã ước lượng hiệu quả tái lập trình từ số lượng
các nhóm tế bào Oct4-GFP1 và tỷ lệ cấy truyền với kiểm soát virus
MX-GFP trên NSCs cho tế bào iPS hai yếu tố OK và iPS bốn yếu
tố bằng chiều thời gian.
Phần II. Nội dung
2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố