BÁO CÁO THỰC TẬP
Báo cáo
“ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V
tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 ”
MỤC LỤC
BÁO CÁO THỰC TẬP 1
Báo cáo 1
“ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 ” 1
MỤC LỤC 2
PHẦN MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặc
tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với
nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực
vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose,
peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai,
bề chắc.[17]
Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các
lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình
xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm
chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh
vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá
trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim
mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.[13]
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm
tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết
quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm.
Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đại

đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN
2
.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN
2
.
- Nghiên cứu một số tính chất vật lý của màng BC được tạo ra từ chủng
A. xylinum BHN
2
từ đó định hướng cho ứng dụng trong trị bỏng.
PHẦN NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về vi khuẩn A. Xylinum và màng BC
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. Xylinum
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum thuộc
giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp
Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số
tác giả coi A. xylinum như một loài phụ của A. Aceti.[21]
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay
không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc
điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi
trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi.

Hình 1: Kết quả nhuộm Gram của A. xylinum BHN
2
Khuẩn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt
2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn
và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.[18]
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A. Xylinum

hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al
2000). Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm. Những dải ribbon
được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác
bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một
lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.[15]
Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết
tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học
cao, khả năng hấp thụ nước lớn.
Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum được nghiên cứu đầu
tiên bởi Brown năm 1886. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX,
những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và
đặc tính của cellulose.[22]
1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC
từ vi khuẩn A.xylinum
1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose
Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng
hợp cellulose của Acetobacter xylinum. Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ
Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng Acetobacter xylinum HN5 thì nguồn cacbon
có ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của Acetobacter xylinum là
glucose. Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như
Quỳnh đã quyết định sử dụng hàm lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu
trên chủng A. xylinum BHN
2
.[14]
1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4

xylinum ( Ross et.al, 1991). Sử dụng nồng độ 2g/l KH
2
PO
4
sẽ cho sản lượng
BC cao nhất.[14]
1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn A.xylinum
1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống.
Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng
trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn.
Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ
kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng.
Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính
chất cơ học của màng BC. Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh
dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng
cung cấp cho hoạt động sống của tế bào.
Đối với loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các
tế bào liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt
nuôi cấy. Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dich
thể. Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho
phù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao nhất.
Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ
giống và thời gian lên men.[14]
1.3.2. Độ thông khí
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện tiên
quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của quá
trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ
thông khí quyết định năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và
sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao

Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại
di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh.
Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận
khoảng hơn 400 ca bỏng. Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi.
Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng.
[6]
Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc
biệt quan
trọng. Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng
làm giảm đau
ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho
quá trình tái tạo
phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại
chỗ có tác dụng lớn
trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm
khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và
dịch trong cơ thể (là nguy cơ
dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức
hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biểu mô hóa hình
thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật.[6]
1.5. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới
1.5.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A.xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1989, dùng
màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất
mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989), Jonas và
Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các
sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc
thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (1989) đã dùng BC làm vải đặc biệt,
Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006)

1.6. Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài
Luận văn thạc sĩ vi sinh học 2009 :
“Nghiên cứu một số đặc tính vật lý của
màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng” của Trần như
Quỳnh- ĐHSP Hà Nội đã làm được một số vấn đề sau:
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum
BHN
2
.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men tạo màng
BC của chủng A.xylinum BHN
2
, qua đó lựa chọn được môi trường thích hợp
cho chủng A.xylinum BHN
2
lên men tĩnh.
+ Điều kiện nuôi cấy: hàm lượng giống bổ sung ban đầu cho lên men tạo
màng là 10% thể tích lên men, với PH ban đầu của môi trường lên men từ
4,5-5,5.
+ Môi trường dinh dưỡng: hàm lượng đường glucose 20g/l; (NH
4
)
2
SO
4
: 2
g/l; KH
2
PO
4

4
)
2
SO
4
- Các muối khoáng: KH
4
PO
4
, CaCO
3
, MgSO
4
.7H
2
O, NaOH, CuSO
4
.
- Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men, cao ngô.
- Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol.
- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
- Ngoài ra còn sử dụng : Các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết quả.
2.1.2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức).
Nồi hấp Tommy (Nhật).
Máy so màu UV – vis ( Nhật).
Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ).
Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).
Máy li tâm Sorvall (Mỹ).
Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20µl – 10ml.

)
2
SO
4
: 3 g
KH
2
PO
4
: 2 g MgSO
4
.7H
2
O: 2 g
Pepton: 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng
Glucose: 20 g (NH
4
)
2
SO
4
: 3 g
KH
2
PO
4

trường lên men 5% giống đã hoạt hóa. Nuôi cấy ở điêu kiện tĩnh trong 7-10
ngày.
2.2.3. Phương pháp bảo quản chủng giống A.xylinum BHN
2
trên môi
trường thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh sẽ được cấy
trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO
3
), nuôi trong tủ ấm 3 –
4 ngày ở 30
0
C. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 4
0
C để bảo quản giống. Cấy truyền giữ
giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần.[4]
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ
chủng A. xylinum BHN
2
2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC
tốt nhất từ chủng A. xylinum BHN
2

S: diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm
2
)
V: thể tích dịch lên men tạo màng ( cm
3
)
Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích

150 215 0,7
150 250 0,6
150 300 0,5
- Bước 2: Tiến hành lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng A.xylinum BHN
2
với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai,
cân nặng, trọng lượng khô để tìm S/V thích hợp tạo màng BC tốt nhất.
2.2.4.2. Phương pháp xác định dai (độ bền cơ học) của màng BC
. Độ chịu kéo(độ dai)(tensile strenght): Lực kéo lớn nhất mà mẫu thử
chịu được trước khi đứt trong điều kiện xác định của phương pháp thử tiêu
chuẩn.[14]
Độ bền kéo(độ dai) có thể được hiểu như là khi một lực tác động tăng
dần đến khi vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt. Ở giá trị lực kéo giới hạn cho sự
đứt của vật liệu được ghi lại được ký hiệu σ
k
. Độ bền kéo được ứng dụng rất
nhiều cho các vật liệu trong các lĩnh vực như thiết kế chế tạo máy, xây dựng,
khoa học vật liệu.[14]
Để xác định độ dai của màng tôi đã dùng một lực kế(đơn vị là N-
Niutơn). Sau khi thu màng tôi tiến hành đo độ dai bằng cách:
+ Cố định đầu trước của màng
+ Tiếp đến lấy lực kế lò xo cố định vào đầu sau
+ Kéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu N.
2.2.4.3. Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN
2
Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đến tỷ lệ S/V thích
hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN
2
theo các tiêu

)(
1
2
−
−
=
∑
=
n
XX
n
i
i
δ
* Sai số đại diện của trung bình cộng
m
n
δ
± =
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:
X
x
C
v
100
δ
=
.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của các tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn A.

sau
khi
lên
men
(mm
)
Độ dai
(độ bền
kéo)
Đơn vị
(N)
Cân
nặng
sau
khi
lên
men
(g)
Trọng
lượng
khô
(g)
0,5 4 Trắng đục,
sần sùi
0,50 6 4,17 0,10
0,6 4 Trắng đục,
sần sùi
1,5 10 8,54 0,14
0,7 4 Trắng đục,
sần sùi

Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo
màng BC tốt nhất từ chủng A. xylinum BHN
2
với tỷ lệ S/V=0,8
Thời gian
(ngày) 1 2 3 4 5 6 7
Xuất hiện
màng
- - + + + + +
Màu sắc,
độ nhẵn
- - Màng
trắng
trong,
nhẵn
Màng
trắng
trong,
nhẵn
Màng
trắng
trong,
nhẵn
Màng
trắng
trong,
nhẵn
Màng
trắng
trong,