127
TẠP CHÍ KHOA HỌC, ðại học Huế, Số 64, 2011

NHÂN NHANH IN VITRO LAN KIM ðIỆP (DENDROBIUM CHRYSOTOXUM) –
MỘT LOÀI LAN RỪNG CÓ NGUY CƠ

TUY
TUYTUY
TUYỆT CHỦNG
Nguyễn Văn Song

Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, ðại học Huế
Phan Hùng Vĩnh, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Quảng Nam
Trương Thị Bích Phượng,

Trường ðại học Khoa học, ðại học Huế
TÓM TẮT
Chúng tôi ñã tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro lan Kim ñiệp. Nguyên liệu sử
dụng là hạt của quả lan 3 tháng tuổi. Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh
protocorm của hạt là MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP.
Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15%
nước dừa và 2,0 mg/l BAP. Môi trường MS cơ bản có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt
tính, 15% nước dừa, 2,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ
protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro. Môi trường MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar,
15% nước dừa và 1,0 mg/l NAA là thích hợp cho tạo rễ của chồi in vitro.
Từ khóa: Dendrobium chrysotoxum, hạt lan, lan quý hiếm, nhân nhanh, protocorm.

1. Mở ñầu
Lan Kim ñiệp (Dendrobium chrysotoxum) là loài lan rừng Việt Nam phân bố chủ

2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là quả lan Kim ñiệp (Dendrobium chrysotoxum) 3 tháng
tuổi thu hái từ cây ngoài tự nhiên.
2 2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khử trùng mẫu
Quả lan ñược ngâm trong nước xà phòng loãng và rửa kỹ dưới dòng nước chảy,
sau ñó khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 2 phút, tiếp ñến khử trùng bề mặt vỏ quả
bằng HgCl
2
0,1% trong 10 phút. Cuối cùng, quả ñược rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng.
2.2.2. Nảy mầm và phát sinh protocorm
Hạt lan thu từ quả ñã khử trùng ñược cấy lên môi trường MS cơ bản (Murashige
and Skoog, 1962) có 8 g/l agar, 20 g/l sucrose, bổ sung 15% nước dừa (CW), 0,5-2,5
mg/l benzylamino purine (BAP), và 0,2-1,5 mg/l napththaleneacetic acid (NAA) ñể
thăm dò khả năng nảy mầm và phát sinh protocorm.
2.2.3. Nhân nhanh protocorm
Các protocorm sau khi hình thành sẽ ñược cấy chuyển lên môi trường MS cơ bản
có 8 g/l agar, 20 g/l sucrose, bổ sung 15% CW, bổ sung BAP, kinetin, NAA riêng rẽ hoặc
phối hợp ở các nồng ñộ khác nhau ñể thăm dò khả năng nảy mầm và nhân protocorm.
2.2.4. Phát triển chồi từ protocorm
Các protocorm sau khi nhân nhanh ñược cấy lên môi trường MS cơ bản có 8 g/l
agar, 30 g/l sucrose, 1 g/l than hoạt tính bổ sung 15% CW và các chất kích thích sinh
trưởng (BAP, NAA và kinetin) riêng rẽ hoặc phối hợp ở các nồng ñộ khác nhau ñể thăm
dò khả năng phát triển chồi. 129
2.2.5. Tạo rễ từ chồi in vitro
Các chồi thu ñược từ các thí nghiệm trên ñược tách riêng rẽ và cấy lên môi

0,2 +++
0,5 ++
1,0 ++
1,5 ++
Chú thích:
- : Không bổ sung chất kích thích sinh trưởng;
++++ : tốt ; +++ : khá
++ : trung bình; +: kém 130
Các hạt lan ban ñầu có màu vàng chanh ñược nuôi cấy in vitro sau 2 tuần ñã
chuyển sang màu nâu vàng, rồi bắt ñầu trương lên. Sau 3-4 tuần hạt tiếp tục trương to và
có hình cầu màu xanh nhạt do lục hóa. Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy ñược trình bày ở
bảng 1.
Số liệu ở bảng 1 cho thấy, BAP và NAA có tác dụng rõ rệt ñối với sự nảy mầm
ñồng thời phát sinh protocorm của hạt so với ñối chứng (không bổ sung chất kích thích
sinh trưởng). Môi trường có BAP (1,0 - 1,5 mg/l) có tác dụng tương ñương với môi
trường có bổ sung 0,2 mg/l NAA. Môi trường có 2,0 mg/l BAP kích thích sự nảy mầm
và phát sinh protocorm tốt nhất. Kết quả nghiên cứu trên lan Nghinh xuân
(Rhynchostylis gigantea) cũng tương tự, nồng ñộ NAA thích hợp là 0,1 mg/l [3]. Tuy
nhiên, ở một số loài Dendrobium sp. thì cần NAA ở nồng ñộ cao hơn lên ñến 0,5 mg/l
NAA [14].
3.2. Nhân nhanh protocorm
Hạt lan nảy mầm có thể sản xuất ra một khối tế bào chưa phân hóa rõ ràng ñược
gọi là protocorm. Tất cả những protocorm này sẽ tiếp tục phát triển trong nhiều tuần,
nhiều tháng hay thậm chí nhiều năm phụ thuộc từng loài cho ñến khi ñủ lớn ñể tạo lá và
rễ [15].
Bảng 2. Ảnh hưởng của BAP, kinetin riêng rẽ hoặc kết hợp với NAA lên khả năng nhân nhanh
protocorm sau 6 tuần nuôi cấy

c 131
LSD
0,05
0,08
- - - 1,80
c
- 0,5 1,0 2,40
bc
- 1,0 1,0 3,62
a
- 1,5 1,0 3,66
a
- 2,0 1,0 2,75
b
- 2,5 1,0 1,83
c
LSD
0,05
0,74
- - -
-
0,5 - 0,5 2,75
b
1,0 - 0,5 3,60
a
1,5 - 0,5 3,12
ab

có 1,0 mg/l NAA. Kinetin có tác dụng tích cực ñến sự phát triển chồi từ mẫu cấy, số
chồi hình thành cao hơn so với môi trường có NAA, tuy nhiên, sự phát triển chiều cao
chồi lại kém hơn. Trên môi trường có 1,0 mg/l kinetin số chồi hình thành cao nhất là
3,16 chồi/protocorm, môi trường có 1,5 mg/l kinetin kích thích sự phát triển chiều cao
chồi Kim ñiệp tương ñối tốt (3,68 cm). Sự phối hợp giữa BAP và NAA có tác ñộng khá
tốt ñến sự hình thành chồi từ protocorm, số chồi thu ñược cao nhất ở môi trường có 2,0
mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA, chiều cao chồi lớn nhất ở môi trường có 2,0 mg/l BAP + 0,5
mg/l NAA. Từ kết quả này cũng cho thấy, với tỷ lệ Cytokinin/Auxin (BAP/NAA) = 2 là
thích hợp nhất cho quá trình tạo chồi từ protocorm của lan Kim ñiệp. Các tỷ lệ khác cho
hiệu quả thấp, ñiều này cũng có thể do hàm lượng auxin nội sinh của mô ñã ảnh hưởng
ñến khả năng tạo chồi của protocorm.
3.4. Sự hình thành rễ của chồi in vitro
Chồi của loài Kim ñiệp thu ñược từ các thí nghiệm trên ñược tách riêng rẽ và
cấy lên môi trường tạo rễ ñể khảo sát khả năng hình thành rễ. Kết quả thí nghiệm sau 6
tuần theo dõi ñược trình bày ở bảng 4.
Kết quả ở bảng 4 cho thấy, sự hình thành rễ của chồi in vitro tốt nhất trên môi
trường có 1,0 mg/l NAA (5,93 rễ/chồi). Chiều dài rễ tương ñương nhau trên các môi
trường có 0,1; 0,3; 0,5 mg/l NAA. Chồi Kim ñiệp hình thành rễ kém trên môi trường có
sự kết hợp giữa kinetin và NAA.
Bảng 3. Ảnh hưởng của BAP, kinetin và NAA lên khả năng phát sinh chồi từ protocorm
Chất kích thích sinh trưởng (mg/l)
Số
chồi/protocorm
Chiều cao chồi (cm)
Kinetin BAP NAA
- - - 1,26
c
2,23
d
- - 0,1 1,43

- 2,0 0,1 1,56
e
2,57
d
- 2,0 0,3 2,09
d
2,95
c
- 2,0 0,5 2,27
cd
3,48
a 133
- 2,0 0,7 2,65
bc
3,25
b
- 2,0 1,0 3,18
a
3,28
b
- 2,0 1,5 2,77
ab
2,85
c
LSD
0,05
0,47 0,12

ñộ phòng trong khoảng 10 ngày ñể cây thích nghi dần. Sau ñó, chuyển cây con ra khỏi
bình nuôi cấy, rửa sạch môi trường, cắt ngắn rễ và nhúng vào dung dịch sát khuẩn
(VIBEN-C 50BTN 0,25 - 0,3 %) trong thời gian 1 phút. Cây con ñược trồng trên giá thể
rêu nước và dương xỉ (tỷ lệ 1:2) ở chế ñộ che sáng 50 % và tưới nước phun sương. Sau
2 tuần, cây con bắt ñầu hình thành rễ mới và hình thành lá mới sau 3 tuần chuyển ra
vườn ươm. Kết quả sau 1 tháng theo dõi, tỷ lệ sống sót ñạt 90,9 %.
Bảng 4. Ảnh hưởng của chất KTST lên khả năng tạo rễ của chồi lan Kim ñiệp in vitro
Chất KTST (mg/l)
Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm)
NAA Kinetin
- - 2,94
e
1,44
c
0,1 - 4,54
d
2,24
a
0,3 - 5,06
c
2,23
a
0,5 - 5,32
b
2,24
a
1,0 - 5,93
a
1,83
b

sung 15% nước dừa và kết hợp 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA hoặc 1 mg/l Kinetin là
thích hợp nhất cho sự phát sinh chồi từ protocorm và sự sinh trưởng của chồi in vitro.
- Môi trường thích hợp cho tạo rễ là MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, bổ
sung 15% nước dừa và 1,0 mg/l NAA.
A B
C D
E
Hình 1. A: Hạt lan nảy mầm sau 6 tuần trên môi trường có 2,0 mg/l BAP.
B: Protocorm sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường có 2,0 mg/l BAP.
C: Chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường có 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l
NAA sau 12 tuần nuôi cấy.
D: Chồi in vitro tạo rễ sau 6 tuần trên môi trường có 1,0 mg/l NAA.
E: Cây con trồng trên giá thể ngoài tự nhiên. 135
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Tiến Bân và các tác giả, Sách ñỏ Việt Nam – Phần II – Thực vật, Nxb Khoa
học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, 2007.
[2]. Trần Hợp, Phong lan Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp, Tp HCM, 1998.
[3]. Nguyễn Hoàng Lộc, Mai Văn Phô, ðiều tra sơ bộ thành phần loài họ lan ở Thừa Thiên
Huế và bước ñầu bảo tồn in vitro một số loài phân bố ở ñây, Tạp chí Sinh học 22(3b),
(2000), 173-178.
[4]. Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, Cây Phong lan Dendrobium sp, Trường ðại học
Nông Lâm Tp HCM, 2001.
[5]. Alvarez-Pardo VM, Ferreira AG, Nunes VF, Seed disinfestation methods for in vitro
cultivation of epiphyte orchids from Southern Brazil, Horticultura Brasileira 24, (2006),
217-220.
[6]. Anjum S, Zia M. and Chaudhary MF, Investigations of different strategies for high
frequency regeneration of Dendrobium malones ‘Victory’, African Journal of

Tropical Conservation, (2000), 1-17.
[16]. Murashige T, Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures, Physiol. Plant 15, (1962), 473-497.
[17]. Park SY, Murthy HN and Paek KY., In-vitro seed germination of calanthe sieboldii,
an endangered orchid species, Joumal of Plant Biology 43(3), (2000), 158-161.
[18]. Roy J, Naha S, Majumdar M, Banerjee N., Direct and callus-mediated protocorm-like
body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl, Plant Cell Tiss
Organ Cult, 90, (2007), 31-39.
[19]. Taniguchi H, Katsumi M, Yamamoto Y, Tatsumi Y, Sano CM, Choi YE and Sano H.,
In vitro proliferation and genetic diversity of Cypripedium macranthos var. rebunense,
Plant Biotechnology, 25, (2008), 341-346.
IN VITRO PROPAGATION OF DENDROBIUM CHRYSOTOXUM - AN
ENDANGERED ORCHID SPECIES
Nguyen Van Song

Institute of Resources, Environment and Biotechnology, Hue University
Phan Hung Vinh
Quang Nam Department of Agricultural and Rural Development
Truong Thi Bich Phuong
College of Sciences, Hue University
SUMMARY
We have carried out in vitro propagation of Dendrobium chrysotoxum. In this report,
the 3-month old seeds were used for propagation. The suitable medium for seed germination
accompanied with protocorm induction is basal MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented
with 15% CW and 2,0 mg/l BAP and for protocorm propagation is basal MS with 20 g/l sucrose,
8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 2,0 mg/l BAP. The basal MS medium + 30 g/l sucrose
+ 8 g/l agar + 1 g/l activated charcoal + 15% CW and 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA was the
most suitable for multi-shoot micropropagation from protocorm and the growing of in vitro
shoots. The suitable medium for rooting is MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented with
15% CW and 1,0 mg/l NAA.