phân hủy một phần như máu khô hóa thạch, tóc, móng tay người chết… Tuy
nhiên, khi mẫu không sạch có lẫn protein sẽ làm cho hiệu quả phản ứng PCR
giảm theo (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm từ 1 g xuống còn 100 ng, khi
giảm nồng độ DNA ban đầu sẽ hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo
những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Việc
sử dụng nồng độ DNA quá cao sẽ tạo ra những kết quả dương tính giả.
2.3.2.2. Primer và nhiệt độ lai
Primer là yếu tố quyết định đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR.
Một phản ứng PCR chuẩn gồm 2 loại primer: primer xuôi và primer ngược.
Trong đó, primer xuôi bắt cặp bổ sung trên sợi sen, còn primer ngược bắt cặp
trên sợi antisen của phân tử DNA mẫu. Việc thiết kế primer đòi hỏi phải đáp
ứng được những nhu cầu sau:
- Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa
primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ
sung giữa các thành phần khác nhau của một primer (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
- Thành phần các nucleotide phải cân bằng. Nếu tỉ lệ G, C cao thì số lượng
nucleotide của mỗi primer sẽ giảm từ 15- 30 nu xuống còn 18 – 20 nu (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Tỉ lệ các nu sẽ ảnh hưởng đến nhiệt độ bắt
cặp của primer, nhiệt độ này được tính theo công thức:
Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C).
Đồng thời nhiệt độ bắt cặp của hai primer không cách biệt quá xa.
- Trình tự được khuếch đại là trình tự DNA nằm giữa hai primer xuôi và
ngược, trình tự này không được quá lớn. Phải nhỏ hơn 1 Kb đối với phản ứng
PCR chuẩn (Khuất Hữu Thanh, 2003) (trích Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005).
- Các primer phải đặc trưng cho trình tự được khuếch đại, không bắt cặp bổ
sung với nhiều trình tự trên hệ gene.
Trong phản ứng PCR thì nồng độ primer khoảng 1 – 25 pM cho phản ứng
25 – 50 l (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).

2+
cho từng phản ứng phải được xác
định qua nhiều phản ứng thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.3.2.5. dNTPs
Nồng độ và thành phần các nucleotide cũng ảnh hưởng đến kết quả PCR.
Nồng độ dNTPs thường sử dụng là 20 – 200 M. Nồng độ dNTPs cao sẽ dẫn
đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide
sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
2.3.2.6. Số lƣợng chu kỳ
Tuy về mặt lý thuyết thì số lượng chu kỳ là không giới hạn, nhưng trên thực
tế thì số lượng chu kỳ thường không vượt quá 40 chu kỳ. Khi số lượng chu kỳ
quá lớn thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ bị giảm theo số lượng chu kỳ.

Nguyên nhân của việc giảm hiệu quả phản ứng PCR là rất nhiều, ví dụ như việc
cạn kiệt các thành phần phản ứng, xuất hiện sản phẩm phụ… Do nhiều lý do
như vậy, nên việc xác định số lượng chu kỳ phụ thuộc rất nhiều vào số lượng
mẫu ban đầu.
2.3.2.7. Nhiệt độ và pH
Do liên kết hydro trong phân tử DNA rất nhạy cảm với nhiệt độ nên việc
xác định nhiệt độ cho phản ứng PCR là vô cùng quan trọng. Với mục đích biến
tính DNA thì thường sử dụng nhiệt độ từ 94 – 96
o
C. Còn trong giai đoạn bắt
cặp thì nhiệt độ thường được sử dụng là 50 – 56
o
C, tuy nhiên nhiệt độ này còn
tùy thuộc vào đặc tính của primer (tỉ lệ G, C). Nếu tỉ lệ G, C cao thì nhiệt độ bắt
cặp cũng sẽ cao theo. Ở nhiệt độ 72
o

Thông thường nhiệt độ cho giai đoạn này là 72
o
C, đây là nhiệt độ hoạt động
tối ưu của enzyme Taq polymerase. Enzyme này sẽ giúp kéo dài mạch mới của
phân tử DNA từ primer. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào chiều dài
của phân tử DNA. Nhưng thường thì thay đổi từ 30 giây đến một vài phút.
Trong phản ứng PCR, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn, và các chu kỳ sẽ được
lặp đi lặp lại nhiều lần. Mỗi lần lặp lại như vậy thì lượng DNA sẽ tăng gấp đôi.
Như vậy lượng DNA sẽ được khuếch đại theo hàm số mũ:
M = m . 2
n

Trong đó: M: lượng DNA sau khi khuếch đại.
m: lượng DNA mẫu ban đầu.
n: số chu kỳ của phản ứng PCR.
2.3.4. Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng PCR
Ưu điểm của phản ứng PCR:
- Thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém.
- Không đòi hỏi mẫu phải tinh sạch cao.
Nhược điểm của phản ứng PCR:
- Đòi hỏi phải biết trình tự nucleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, hay
chí ít cũng phải biết trình tự hai đầu của phân tử DNA.
- Chỉ khuếch đại những phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn 3 Kb, tốt
nhất là 1 Kb.
- Rất dễ bị nhiễm, dẫn đến tạo sản phẩm phụ (dương tính giả).
2.3.5. Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Do có khả năng khuếch đại một lượng DNA cực nhanh và chuyên biệt nên
kỹ thuật PCR được áp dụng rộng rãi trên rất nhiều lĩnh vực.
- Sản xuất các mẫu dò
Trước khi kỹ thuật PCR ra đời, việc sản xuất các mẫu dò đòi hỏi phải qua

Tên gọi thống nhất cho các enzyme cắt được quy định như sau:
- Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên giống vi khuẩn dùng để ly trích enzyme RE.
- Hai chữ kế không viết hoa tương ứng với loài của vi khuẩn nói trên.

- Tiếp theo là một chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện (trong trường
hợp nhiều RE cùng được tìm thấy ở một loài vi khuẩn).
Đôi khi còn sử dụng một chữ viết hoa để chỉ chủng của vi khuẩn sử dụng
(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
Ví dụ:
Escherichia coli Ry13 và được viết tắt là EcoR.
Giống Loài Chủng.
Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó
Nguồn vi khuẩn
Ký hiệu enzyme
Trình tự
5’ – 3’
3’ – 5’
Haemophilus aegyptius

Staphylococcus aureus 3A

Bacillus amyloliquefaciens H

Escherichia coli RY13

Haemophilus influenzae Rd

Providencia stuartii

Seratia marcesens

CCC/GGG
GGG/CCC
C/CCGGG
GGGCC/C(Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.4.1.3. Các loại RE
Do đặc tính nhận biết và cắt DNA tại những vị trí khác nhau, người ta chia
các enzyme cắt giới hạn thành 3 loại:

- Loại 1: Khi enzyme nhận biết trình tự cắt, nó sẽ di chuyển trên phân tử
DNA đến cách đó khoảng 1.000 – 5.000 nu và giải phóng độ vài chục nu.
- Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự và cắt luôn tại trình tự đó.
- Loại 3: Enzyme nhận biết một trình tự đặc trưng và cắt DNA ở vị trí cách
đó khoảng 20 nu.
Tuy có 3 loại enzyme cắt giới hạn nhưng chỉ có loại 2 là được sử dụng trong
nghiên cứu sinh học phân tử.
2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE
Ở sinh vật nhân thật, việc phân tích cả hệ gene là rất khó khăn. Do đó việc
sử dụng enzyme cắt giới hạn để cắt nhỏ bộ gene khổng lồ là cần thiết để dễ
dàng hơn trong nghiên cứu.
Các nhà khoa học còn sử dụng RE trong nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn, lập
bản đồ giới hạn hay so sánh bộ gene ở các loài khác nhau bằng kỹ thuật RFLP.
2.4.2. Sơ lƣợc về phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
2.4.2.1. Giới thiệu chung
RFLP là phương pháp sử dụng một enzyme cắt giới hạn (RE) để cắt một
mẫu DNA, sau đó sẽ so sánh số band DNA tạo thành thông qua kỹ thuật điện di
để xác định đột biến điểm hay sự khác nhau của các trình tự DNA.

- Điện di và nhuộm ethidium bromide để kiểm tra kết quả.
Ngoài các ưu điểm trên, so với phương pháp RFLP thông thường thì phương
pháp RFLP – PCR còn có nhiều ưu điểm như: cần lượng DNA mẫu ít, đọc kết
quả điện di trực tiếp bằng mắt không dùng đồng vị phóng xạ mà chỉ sử dụng
ánh sáng huỳnh quang để đọc kết quả.

2.5. Giới thiệu về vùng ITS
Vùng ITS là vùng nằm xen kẽ với các trình tự rDNA (Hình 2.3). Các trình
tự rDNA mã hóa cho các rRNA, các rRNA sẽ kết hợp với protein để tạo ra
ribosome có chức năng tổng hợp protein. Trong các vùng này thì vùng rDNA là
vùng bảo tồn nhất, kế đến là vùng ITS còn vùng biến động nhất là vùng IGS.

Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS của nấm
(Nguồn:
Đặc điểm của vùng ITS (Bridge và cộng sự, 2000):
- Đây là vùng có kích thước ngắn (khoảng 500 – 800 bp), dễ dàng khuếch
đại bằng phản ứng PCR.
- Vùng ITS có tính bất ổn hơn vùng gene mã hóa rDNA.
- PCR có thể khuếch đại vùng này bằng các primer đặc trưng. Các nhà
nghiên cứu đã lựa chọn vùng ITS để tìm những vùng gene đặc trưng cho loài,
từ đó giúp xác định loài nhanh chóng.
Do tính chất như vậy mà vùng ITS đã được sử dụng nghiên cứu với mục
đích là tìm ra và xác định sự đa dạng di truyền của nhiều loài nấm (Carbone và
Kohn, 1993; Hallenberg và cộng sự, 1996; Hirata và Takamatsu, 1996). Năm

1996, Edel và cộng sự tiến hành phân tích RFLP trên vùng ITS và đã tìm ra một
vài sự khác biệt trên nấm Fusarium oxysporum.
Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều kỹ thuật như PCR, RFLP,
DNA sequencing để nghiên cứu vùng ITS (Kuninaga và cộng sự, 1997). Đối
với các loài nấm, vùng ITS có tính bảo tồn khá cao đối với các dòng nấm có

nhiều. Ngoài những nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh còn có các
nghiên cứu về khả năng kháng bệnh này của một số dòng vô tính cao su. Vũ
Thị Quỳnh Chi (2005) đã sử dụng các enzyme EcoR I, Msp I, Cfo I, Hae III,
Sau 3A, Rsa I để phân tích đa dạng di truyền trên 7 dòng nấm C. cassiicola
(RRIV 2, RRIV4, AC 88, RO/CM/10, MT/C/5, LH 82/008, LH 83/152), kết
quả không tìm thấy sự đa hình nào khi cắt bằng các enzyme giới hạn trên.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về loại nấm này. Đa số các nghiên
cứu đều tập trung vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khả năng gây
bệnh… của chúng. Kết quả các nghiên cứu này đã chứng minh đây là một loài
nấm nguy hiểm, có khả năng bùng phát trên diện rộng. Ngoài khả năng sinh độc
tố, nấm này còn có khả năng tổng hợp enzyme phân hủy peptin và cellulose
(C.K. Jayashinge, 2000).
Năm 1995, Silva và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD – PCR để phân tích
sự khác biệt về mặt di truyền của 42 dòng nấm C. cassiicola khác nhau và đã
phân thành 5 chủng nấm khác nhau và đã xếp chúng vào 3 nhóm di truyền.
Ngoài kỹ thuật RAPD, kỹ thuật RFLP – PCR cũng đã được sử dụng để
nghiên cứu sự đa hình của các dòng nấm. Năm 2003, Safiah Atan và Noor
Hisham Hamid đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP – PCR để phân tích sự
khác biệt về mặt di truyền của 9 dòng nấm. Kết quả là đã xếp chúng vào 2
chủng khi nghiên cứu bằng RAPD. Kết quả phân tích với kỹ thuật RFLP – PCR
cho thấy không có sự sai khác đáng kể nào trong 9 dòng nấm được nghiên cứu.
Năm 1998, Silva và cộng sự đã dùng kỹ thuật RAPD và phân tích RFLP
trên vùng ITS của 32 dòng nấm. Ông không tìm thấy sự đa hình nào khi nghiên
cứu bằng kỹ thuật RFLP –PCR, còn với kỹ thuật RAPD đã phân 32 dòng nấm
này thành 7 nhóm di truyền.
PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Môi trường PGA, PSA: Đường glucose hay sucrose, khoai tây, agar.
Thuốc nhuộm Methylene Blue.
Nước cất.
Cách pha môi trƣờng PGA:
Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 200g, thái nhỏ, thêm 500 ml nước cất 2
lần đun sôi trong 30 phút.
Lọc lấy nước trong.
Thêm 15g agar và 500 ml nước cất vào dung dịch đã lọc.
Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml và thêm 20g đường glucose.
Đun sôi trong 30 phút, khuấy đều trong lúc nấu.
Phân vào các đĩa petri và các ống nghiệm (10 ml/ ống) và đem hấp khử
trùng ở 121 C/ 15 phút.
3.3.1.2. Phƣơng pháp lấy mẫu
Lấy nguyên cả mẫu lá có triệu chứng bệnh, đặt trong hộp đựng mẫu có giấy
thấm nước để giữ ẩm. Mẫu được ghi đầy đủ dữ liệu như: nơi lấy mẫu, dòng vô
tính cao su lấy mẫu (tình trạng mẫu, lá non, lá già, triệu chứng đặc trưng (hình
xương cá) hay không đặc trưng (vết tròn)…)
3.3.1.3. Phƣơng pháp phân lập nấm
Mẫu nấm được phân lập từ các vết bệnh đặc trưng hoặc không đặc trưng của
bệnh rụng lá Corynespora theo các bước sau:
- Mẫu đưa về phòng thí nghiệm được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần.
- Dùng que cấy lấy trực tiếp bào tử và cấy vào môi trường PGA. Hoặc cắt
mẫu thành những miếng nhỏ, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, cồn 70
o
rồi cấy
vào môi đĩa môi trường PGA.
- Ủ hai ngày. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường mới.
- Tiếp tục cấy truyền đến khi thu được giống nấm thuần chủng.
Tiến hành quan trắc bào tử nấm C. cassiicola.
Tiến hành nuôi cấy tách đơn bào tử.

- Isoamyl alcohol.
- Isopropanol.
- Ethanol 100%, 70%
- TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0.
- Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% -
mecaptoethanol.
- Dụng cụ thí nghiệm gồm: Cối và chày để nghiền mẫu, eppendorf,
micropipette và các loại đầu tip, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex…
3.3.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA
DNA nấm được tách chiết theo phương pháp của Lee & Taylor (1990).
Quy trình cụ thể
- Lấy 1g sợi nấm khô kiệt nghiền trong dung dịch nitơ lỏng.
- Chuyển bột nghiền vào eppendorf.
- Thêm 300 l lysis buffer, trộn đều. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis
buffer.
- Ủ ở 65
o
C trong 1giờ.
- Di chuyển ống nghiệm ra khỏi bồn ổn nhiệt.
- Thêm 300 l phenol: chlorophorm: isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) lắc nhẹ.
- Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ 28
o
C.
- Chuyển dịch nổi (khoảng 300 l) vào eppendorf mới.
- Kết tủa DNA bằng cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ.
- Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở 28
o
C.
- Loại bỏ dịch lỏng. Dùng ethanol 70
o

- Bước 7: Loại bỏ dịch nổi. Tiến hành làm khô mẫu và cho TE 1X vào.
3.3.3. Khuếch đại vùng ITS của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.)
Wei bằng kỹ thuật PCR
3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
2 primer: ITS A GGGAATTCTCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS B GCAAGCTTTCCTCCGCTTATTGATATGC
Dụng cụ thí nghiệm:
Eppendorf các loại.
Micropippette và đầu típ các loại.
Lò vi sóng.
Cân kỹ thuật 4 số.
Máy luân nhiệt (thực hiện phản ứng PCR).
3.3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR
Bảng 3.1: Thành phần một phản ứng PCR
Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối
dNTP 0,5 10 mM 0,2 mM
10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X
MgCl
2
1 25 mM 1 mM
ITS A 1 25 pM/ l 25pM
ITS B 1 25 pM/ l 25pM
Taq polymerase 0,1 5U 0,5U Khuôn mẫu 1
Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR: thực hiện trong 41 chu kỳ.
- Chu kỳ 1:

C.
- Đổ gel vào bể điện di và đặt lược tạo giếng diện di.
- Chờ gel đông lại. Cho vào bể điện di và đổ dung dịch TAE vào.
- Lấy 4 l sản phẩm PCR trộn với 2 l loading dye cho vào
giếng và tiến hành chạy điện di.
- Phân tích sản phẩm PCR bằng máy chụp gel.
3.3.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei
3.3.4.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Các enzyme cắt giới hạn Hae III, Alu I, Nde II, Sau 3A I, EcoR I, Cfo I, Rsa I.
- Sản phẩm PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola.
- Bồn ủ nhiệt, gel agarose, máy điện di (Biorad), máy chụp gel (Biorad).
- Đầu tip 10 l, 100 l, eppendorf 0,2 ml.
3.3.4.2. Thực hiện phân tích RFLP
Bảng 3.2: Thành phần một phản ứng enzyme cắt
Thành phần
Liều lượng phản ứng ( l)
Nồng độ đầu
Nồng độ cuối
Enzyme
Buffer enzyme
Sản phẩm PCR
Nước
0,1
2,5
3
vừa đủ phản ứng 25 l
10 U/ l
10 X
1U

bước đầu đã được ngăn chặn bằng cách chặt bỏ các dòng vô tính bị nhiễm. Đồng
thời khuyến cáo không trồng các dòng vô tính cao su có tính mẫn cảm cao. Theo
đánh giá của các nhà nghiên cứu thì ở Việt Nam bệnh này đang trong giai đoạn ủ
bệnh và tích lũy bệnh, do đó trong tương lai có thể bùng phát thành dịch bệnh nếu
không có những biện pháp quản lý và kiểm soát bệnh (Phan Thành Dũng – Báo
cáo công tác bảo vệ thực vật ngành cao su Việt Nam, hiện trạng và thách thức mới,
2006).
Bệnh rụng lá Corynespora là một bệnh mới xuất hiện, quy mô gây hại tiềm ẩn
rất lớn. Chúng ta phải thường xuyên kiểm tra ở tất cả các vườn cao su từ vườn ươm đến vườn cây khai thác. Hiện nay, theo số liệu thống kê do Bộ môn Bảo Vệ Thực
Vật – Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam thì hầu hết các vườn tuyển non và
vườn sơ tuyển tại Lai Khê đều bị nấm này tấn công trên quy mô lớn (Bảng 4.1).

Bảng 4.1: Tình hình nhiễm bệnh tại một số vƣờn trên địa bàn Lai Khê – BD Tên vƣờn

Ngày
quan trắc
Số dòng
vô tính
quan trắc
Số dòng
có triệu
trứng
bệnh
Phần trăm

47
88,9

95,1

61,1

63,5
Theo Bảng 4.1, tỷ lệ dòng vô tính cao su bị nhiễm bệnh là rất lớn. Tại các vườn
tuyển non, tỷ lệ nhiễm bệnh cao có thể lý giải là do số lượng dòng vô tính rất lớn
và khỏang cách giữa các cây là rất gần nhau. Do đó bệnh dễ dàng lây lan giữa các
dòng với nhau. Còn các vườn sơ tuyển, đây là vườn lưu trữ các giống có tiềm năng
đã qua chọn lọc nên tỷ lệ nhiễm bệnh có thấp hơn vườn tuyển non. Tuy nhiên, tỷ lệ
nhiễm bệnh này là rất cao, cần có các biện pháp hợp lý để hạn chế sự phát triển của
bệnh này.
Theo thống kê chưa đầy đủ, tại các công ty cao su trực thuộc Tổng công ty cao
su Việt Nam bệnh rụng lá Corynespora cũng đã xuất hiện và gây thiệt hại lớn trên
cây cao su con.
Trong quá trình tiến hành làm thí nghiệm, tôi đã tiến hành thu thập mẫu nấm từ
các mẫu lá có triệu chứng bệnh của nhiều dòng vô tính cao su khác nhau tại Vườn
tuyển non Lai Khê - Viện nghiên cứu cây cao su Việt Nam (Hình 4.1). Để đơn giản và thuận tiện cho công việc tôi đã tiến hành mã hóa tên các dòng nấm thu được từ
các dòng vô tính khác nhau thành các số thứ tự (xem Phụ lục 1.).
Hình 4.1. Triệu trứng bệnh rụng lá Corynespora
A: Lá mới bị bệnh C: Triệu trứng trên thân cây non

A
B