BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000*** NGÔ QUANG HƢỞNG

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000*** STUDYING GENETIC DEVERSITY OF Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei POPULATION, DESTRUCTIVE FUNGAL
PATHOGEN OF Hevea brasiliensis Muell. Arg.
AT LAI KHE (BEN CAT – BINH DUONG), WAS CARRIED
OUT BY USING RFLP – PCR Graduation thesis
Major: Biotechnology Professor: Student:
PhD. BUI CACH TUYEN NGO QUANG HUONG
MSc. PHAN THANH DUNG Term: 2002 - 2006

tích thí nghiệm hoá sinh - Đại học Nông Lâm TP. HCM đã giúp đỡ tôi vượt qua
khó khăn để hoàn thành tốt khóa luận .
Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 28 - Trường ĐH.
Nông Lâm TP. HCM đã luôn ở bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẽ vui
buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận.
Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng
dục con nên ngƣời, để Con đƣợc nhƣ ngày hôm nay.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006.
Sinh viên Ngô Quang Hưởng.

TÓM TẮT

NGÔ QUANG HƢỞNG, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh,
tháng 8/2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora
cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis
Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng kỹ thuật RFLP –
PCR”.

Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến
ThS. Phan Thành Dũng

Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, tại Viện Nghiên Cứu
Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương và tại Trung tâm Phân
tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội.
Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu
về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết. Bệnh rụng


MỤC LỤC

PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ .................................................................................................................. iii
Tóm tắt ....................................................................................................................... iv
Mục lục ...................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... x
Danh sách các bảng .................................................................................................. xi
Danh sách các hình ................................................................................................... xii
1. MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu ....................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2

2.3.3.5. dNTPs ....................................................................................... 12
2.3.3.6. Số lượng chu kỳ ....................................................................... 12
2.3.3.7. Nhiệt độ và pH ......................................................................... 13
2.3.3.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR .......................................... 13
2.3.4. Các bước thực hiện một phản ứng PCR ............................................. 13
2.3.5. Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR ............................................... 14
2.3.6. Ứng dụng của kỹ thuật PCR ............................................................... 14
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP ........................................................................ 15
2.4.1. Sơ lược về enzyme cắt giới hạn ......................................................... 15
2.4.1.1. Giới thiệu chung ....................................................................... 15
2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn .............................................. 15
2.4.1.3. Các loại RE .............................................................................. 16
2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE ................................................. 17
2.4.2. Sơ lược về phương pháp RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) ............................. 17
2.4.2.1. Giới thiệu chung ....................................................................... 17
2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP ................................ 17
2.4.2.3. Sơ lược về kỹ thuật RFLP – PCR ............................................ 18
2.6. Giới thiệu về vùng ITS ................................................................................. 19
2.7. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora
cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nước và ngoài nước ......................... 20

3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................................... 22
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành .............................................................. 22
3.1.1. Thời gian ....................................................................................... 22
3.1.2. Địa điểm ........................................................................................ 22
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 22
3.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
3.3. Vật liệu và phương pháp .............................................................................. 22
3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối .......................................... 22

4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola ........ 40
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 46
5.1. Kết luận .................................................................................................... 46
5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 46
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 48
7. PHỤ LỤC ........................................................................................................... 52 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism.
CLFP: Corynespora leaf fall disease.

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Một vài RE và vị trí cắt của nó ................................................................ 16
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR ...................................................................... 26
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng enzyme cắt ............................................................ 28
Bảng 4.1. Tình hình nhiễm bệnh tại một số vườn
trên địa bàn Lai Khê – Bình Dương ......................................................... 30
Bảng 4.2. Các dòng nấm được tách đơn bào tử ........................................................ 33
Bảng 4.3. Thành phần phản ứng PCR đã có thay đổi............................................... 39
Bảng 4.4. Kích thước các đoạn DNA sau khi phân cắt bằng các enzyme giới hạn ... 44
PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đối với thực vật thì những tác nhân gây thiệt hại về năng suất, chất lượng
chủ yếu là sâu hại, virus hoặc nấm gây ra. Trên cây cao su cũng vậy, đặc biệt là
các loại bệnh do nấm và vi khuẩn. Ngay từ khi xuất hiện, bệnh rụng lá do nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra đã gây thiệt hại rất lớn đối
với năng suất và chất lượng của nhiều cây trồng khác nhau (khoảng trên 11 loại
cây vùng nhiệt đới) như đậu nành, đu đủ, cao su…Từ đó, ảnh hưởng rất lớn đến
nền kinh tế của các quốc gia, đặc biệt là các quốc gia có thu nhập chính từ nông
nghiệp, trong đó có Việt Nam.
Đối với cây cao su bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola gây ra hay
còn gọi là bệnh rụng lá Corynespora (CLFD) đã gây thiệt hại rất nghiêm trọng
đối với ngành cao su ở nhiều quốc gia, lãnh thổ trên thế giới. Đợt dịch bệnh
bùng phát đầu tiên trên cây cao su vào năm 1985 đã gây rất nhiều sự chú ý của
các nhà khoa học. Cho đến nay, tính chất của bệnh rụng lá Corynespora càng
ngày càng nghiêm trọng, quy mô và phổ ký chủ càng ngày càng mở rộng. Đồng
thời nấm Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn. Bệnh
này làm rụng lá trên quy mô lớn ảnh hưởng đến năng suất mủ của cây cao su.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên trên cây cao su vào tháng 9/1999
tại các nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. Nó đã gây ra cho
ngành cao su những mối lo mới và ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của
ngành cao su. Lúc mới xuất hiện, bệnh chỉ xuất hiện trên một số ít dòng vô tính
như RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Tuy nhiên, ngày càng có nhiều dòng
vô tính bị nhiễm bệnh này.
Hiện trên thế giới đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora
cassiicola. Tuy nhiên những nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ hình
thái cũng như đặc điểm sinh lý của nấm, còn những nghiên cứu về mặt sinh học PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg
2.1.1. Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis Mull. Arg trên thế giới và tại
Việt Nam
Cây cao su có tên khoa học là Hevea brasiliensis Mull. Arg., thuộc họ
Euphorbiaceae (họ thầu dầu) có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 36. Đây là loại
cây công nghiệp dài ngày (chu kỳ khai thác là 20 – 30 năm), có giá trị tổng hợp
trong tất cả các lĩnh vực nông – lâm – ngư nghiệp. Cây cao su có nguồn gốc từ
vùng nhiệt đới và lưu vực sông Amazone (Nam Mỹ). Sau đó đến năm 1876, cây
cao su được du nhập vào Châu Á và Châu Phi bởi H. Wickham. Khi Pháp đô hộ
nước ta thì ngoài những thay đổi về mặt chính trị thì các nhà tư bản Pháp khi
vào Việt Nam cũng đã làm biến đổi cả cơ cấu cây trồng, đặc biệt là các cây
công nghiệp. Cây cao su cũng là một loại trong số đó, năm 1877 hai cây cao su
đầu tiên do một người Pháp tên là Pierre đem về trồng tại Thảo Cầm Viên (Sài
Gòn) nhưng sau đó hai cây này đã bị chết.
Sau nhiều nỗ lực trong việc đưa cây cao su vào Việt Nam thì cuối cùng
vườn cây cao su đầu tiên cũng đã được trồng tại Suối Dầu – Nha Trang do bác
sĩ Yersin (Theo Đặng Văn Vinh, 2000). Có được thành công đó phải kể đến nỗ
lực của Seeligmann khi ông liên tiếp trong 2 năm 1881 và 1883 đã gửi cây cao
su về Sài Gòn trồng.
Yếu tố chính trị quyết định rất lớn đến sự phân bố và phát triển của cây cao
su trên thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng. Sau khi người Pháp đã
thành công trong việc đưa cây cao su vào trồng tại Việt Nam, thì hàng loạt
vườn cao su đã được trồng với mục đích thí nghiệm trong khoảng thời gian

2.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ, lƣợng mƣa, tốc độ gió đến sự phát triển cây
cao su
Nhiệt độ tốt nhất đối với cây cao su là 25 – 30
o
C, trên 40
o
C cây sẽ khô héo,
còn dưới 10
o
C trong thời gian dài cây sẽ héo, rụng lá, rụng chồi… Còn nếu
nhiệt độ ở 5
o
C thì cây sẽ chết.

Lượng mưa thay đổi tùy theo tình trạng đất. Thông thường lượng mưa thuận
lợi nhất là từ 1.500 – 2.000 mm/năm, còn ở những vùng đất không thuận lợi thì
lượng mưa cần là 1.800 – 2.000 mm/năm.
Tốc độ gió có lợi cho cây cao su là từ 1 – 2 m/giây. Nếu tốc độ gió cao từ
8 – 13,8 m/giây sẽ làm lá cây bị rách, bị co lại, phiến lá dày lên. nhỏ lại.
Nhiệt độ, lượng mưa và tốc độ gió thuận lợi cho sự phát triển cây cao su thì
cũng thuận lợi cho sự phát triển của nấm.
2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su
Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, rất nhạy cảm với thời tiết. Do
vậy, cây cao su bị rất nhiều côn trùng và vi sinh vật gây hại. Hiện nay, trên cây
cao su có rất nhiều bệnh như bệnh về lá, bệnh về thân cành, bệnh rễ... (Kỹ thuật
bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004). Các bệnh này ảnh hưởng
rất lớn đến sản lượng và phẩm chất mủ. Đặc biệt là các bệnh về lá như bệnh
phấn trắng do nấm Oidium heveae Steinm gây ra, bệnh héo đen đầu lá do nấm
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) gây ra, bệnh rụng lá mùa mưa do nấm
Phytophthora spp. Và nghiêm trọng nhất là bệnh rụng lá Corynespora do nấm

phân tử phát triển, càng khẳng định nhận định của Wei là hoàn toàn đúng.
Nấm C. cassiicola ký sinh trên rất nhiều loài ký chủ khác nhau nhờ khả
năng biến đổi sinh hóa rất nhanh. Nhưng mãi đến năm 1949, bệnh mới được
phát hiện trên cây cao su đầu tiên ở Sri Lanka. Sau đó chúng xuất hiện rất nhiều
ở các quốc gia trồng cao su khác như Thái Lan, Indonesia, Braxin…Tuy xuất
hiện sớm nhưng đợt dịch bệnh đầu tiên gây nhiều sự chú ý của các nhà khoa
học xảy ra vào năm 1985 tại Sri Lanka. Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu
tiên tại một số nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên vào năm
1999.
2.2.2. Đặc điểm phân loại học của nấm Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei
Nấm C. cassiicola có hệ thống phân loại học như sau:
- Ngành: Ascomycota.
- Lớp: Ascomycetes.
- Bộ: Pleosporales.
- Họ: Corynesporascaceae.
- Giống: Corynespora.

2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei
Trong môi trường tự nhiên, nấm phát triển trên thực vật bằng cách thức ký
sinh hay hoại sinh trên xác bã thực vật. Chúng phát triển rất nhanh nhờ phát
sinh bào tử. Khuẩn ty của nấm có màu sắc biến thiên từ màu xám trắng đến
xám đen và nâu. Hình dạng bào tử cũng rất đa dạng từ hình lưỡi liềm đến hình
que. Bào tử có màu nâu nhạt, ở dạng đơn nhưng đôi khi ở dạng chuỗi dính có
chứa nhiều vách ngăn chiều dài khoảng 700 m (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây
cao su – Phan Thành Dũng, 2004).
Bào tử của nấm được phát tán nhờ gió và mưa. Nó được phóng thích vào
ban ngày và cao điểm từ 8 – 11 giờ (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan
Thành Dũng, 2004). Trong môi trường tự nhiên, số lượng bào tử phụ thuộc

năng thích nghi với điều kiện môi trường cao. Trong những điều kiện khác nhau
nấm dễ dàng biến đổi sinh hóa để hình thành nòi mới. Ngoài yếu tố môi trường
thì yếu tố ký chủ và các dòng vô tính mẫn cảm cũng là các yếu tố giúp phát sinh
nòi mới.
- Môi trƣờng thuận lợi: Trong môi trường thuận lợi nấm sẽ phát triển
nhanh và gây hại trên diện rộng.
2.2.4. Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng của bệnh rụng lá
Corynespora
Nấm Corynespora cassiicola gây bệnh trên rất nhiều loại ký chủ và trên
phạm vi toàn thế giới. Nấm tấn công nhiều loại cây trồng từ các cây rau màu
như rau diếp, dưa gang, cà chua hay các cây công nghiệp như đu đủ, cao su, cây
gai…Trong đó, nấm Corynespora cassiicola gây bệnh trên cây cao su mang
tính chuyên biệt cao.
Do khả năng thích ứng rất lớn đối với thời tiết mà bệnh do nấm này gây ra
đã được ghi nhận ở rất nhiều nước, từ các nước ở vùng ôn đới đến các nước ở
vùng nhiệt đới như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Sri Lanka, Việt Nam…
Bệnh này tấn công trên cả lá non, chồi và lá trưởng thành, đặc biệt là gân lá.
Triệu chứng của bệnh cũng biến đổi tùy thuộc vào loại ký chủ và vị trí gây
bệnh.

- Triệu chứng trên lá: Đầu tiên, xuất hiện các đốm nâu hơi vàng sau đó
vết bệnh lan rộng thành đốm tròn hoặc phân nhánh theo hình xương cá. Trên lá
trưởng thành, nấm sẽ gây chết từng phần tại các vết bệnh, sau đó lá chuyển sang
màu vàng và bị rụng. Trên lá non, nấm sẽ làm lá quăn và rụng.
- Trên chồi và cuống lá: Chồi xanh dễ bị nhiễm hơn chồi đã hóa nâu.
Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ
rỉ ra và sau đó hóa đen. Vết bệnh phát triển dài đến khoảng 20 cm sẽ gây chết
chồi, đôi khi chết cả cây. Nếu bệnh phát triển trên chồi thì sẽ gây rụng hết lá
chét ngay khi còn xanh (Phan Thành Dũng, 2004).
2.2.5. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nƣớc trồng nhiều cao su

Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải nhiều trở
ngại về số lượng vật liệu di truyền cần sử dụng. Mặc dù đã có những phương
pháp để làm tăng số lượng vật liệu di truyền như tạo dòng nhờ vi khuẩn, tuy
nhiên các kỹ thuật này thường phức tạp và cần nhiều thời gian. Do đó, việc phát
minh ra kỹ thuật PCR là một bước tiến vĩ đại trong lịch sử nghiên cứu sinh học
phân tử.
Năm 1985, Kary Mullis và cộng sự đã phát minh ra kỹ thuật PCR và đến
năm 1988 thì Saiki đã hoàn thiện kỹ thuật này. Việc sử dụng enzyme Taq DNA
polymerase trong phản ứng PCR là một bước tiến cực kỳ quan trọng trong các
thí nghiệm sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Kỹ thuật PCR về bản chất là phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự
hiện diện của tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Phương pháp PCR sẽ
khuếch đại đoạn DNA nằm giữa cặp primer. Theo nguyên tắc trên thì yêu cầu
của phản ứng PCR là phải biết được trình tự đoạn DNA, đặc biệt là trình tự hai
đầu của đoạn DNA cần khuếch đại (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả
phản ứng PCR
2.3.2.1. DNA mẫu
Ưu điểm lớn nhất của phản ứng PCR là có độ nhạy cao. Kết quả phản ứng
PCR tối ưu khi DNA sử dụng có độ tinh sạch cao. Mặc dù vậy phản ứng PCR
cũng cho kết quả tốt đối với những mẫu thu trực tiếp mà không qua tinh sạch
hay DNA thu được từ những mẫu không được bảo quản tốt, những mẫu đã bị

phân hủy một phần như máu khô hóa thạch, tóc, móng tay người chết… Tuy
nhiên, khi mẫu không sạch có lẫn protein sẽ làm cho hiệu quả phản ứng PCR
giảm theo (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm từ 1 g xuống còn 100 ng, khi
giảm nồng độ DNA ban đầu sẽ hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo
những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Việc
sử dụng nồng độ DNA quá cao sẽ tạo ra những kết quả dương tính giả.

trong các thí nghiệm về sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,
1999).
Enzyme Taq polymerase được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus.
Đây là vi khuẩn sống ở suối nước nóng, vì vậy chịu được nhiệt độ cao. Enzyme
Taq polymerase thu được từ vi khuẩn này cũng chịu đựng được nhiệt độ cao,
đặc điểm này rất phù hợp với điều kiện của phản ứng PCR.
2.3.2.4. Mg
2+

Là thành phần trong dung dịch đệm, là chất xúc tác của enzyme DNA
polymerase. Do đó, Mg
2+
ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR. Nồng độ
cao hay thấp của Mg
2+
ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của enzyme Taq
polymerase, ảnh hưởng đến quá trình tách mạch đơn của phân tử DNA. Nếu
nồng độ enzyme thấp sẽ ức chế hoạt động của enzyme, còn nếu nồng độ cao tuy
giúp mạch kép của DNA ổn định hơn nhưng lại ức chế sự biến tính hoàn toàn
chuỗi DNA. Nồng độ Mg
2+
ở mức quá cao sẽ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa
primer và khuôn. Nồng độ tối ưu của Mg
2+
cho từng phản ứng phải được xác
định qua nhiều phản ứng thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.3.2.5. dNTPs
Nồng độ và thành phần các nucleotide cũng ảnh hưởng đến kết quả PCR.
Nồng độ dNTPs thường sử dụng là 20 – 200 M. Nồng độ dNTPs cao sẽ dẫn
đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide