26

- Đặt màng vào trong tủ sấy ở 65-80
0
C trong khoảng 1 giờ cho đến khi các
góc màng co lại là được.
3.5.4.5. Cố định DNA lên màng nitrocellulose
Màng sau khi được làm khô, được đem xử lý dưới UV trong tủ GS GENE
LINKER
TM
UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng
hướng lên). Sau đó, màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong
hộp kín cho đến khi tiến hành lai).
3.5.5. Thực hiện lai Southern sử dụng probe pMGY-SB
3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai
Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 55
0
C, đồng
thời làm nóng dung dịch đệm lai ở 55
0
C. Song song đó, chúng tôi tính toán các thông
số sau:
Diện tích màng: 20 x 12 = 240 (cm
2
)
Thể tích đệm lai: 0.2 x 240 = 48 (ml)
Nồng độ probe cần: 10 x 48 = 480 (ng)
Thể tích probe: 480 / 10 =48 (µl)
 Qui trình thực hiện phản ứng lai
Bước 1: Tiền lai
Khi nhiệt độ của buồng lai đạt ổn định ở 55

Màng sau khi được rửa lần 2, sẽ được phủ lên trên một lớp dịch của chất phát
hiện, chất này làm cho các phân tử probe phát sáng. Các bước thực hiện như sau:
- Dùng saran wrap trải trên một mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ một lớp
khăn giấy.
- Lấy màng từ trong dung dịch rửa 2 ra, phải ráo và đặt lên trên miếng saran
wrap với bề có DNA hướng lên trên.
- Hút 1000 µl chất phát hiện CDP- Star nhỏ lên trên màng.
- Dùng một tấm saran wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện
bằng que thủy tinh, tránh để lại bọt khí.
- Sau đó, màng lai được lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với
kích thước phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để
màng bị khô).
 Ủ màng nitrocellulose với X-ray phim trong cassette
Màng được đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica
30 x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của màng. Đậy cassette lại và tính thời
gian ủ 30 phút hoặc 1 giờ (thường phản ứng sẽ có tín hiệu sáng tốt nhất sau 1 giờ từ
khi cho chất phát hiện vào). Tùy theo tính chất probe mà thời gian ủ phản ứng phát
hiện khác nhau. Các thao tác trên được thực hiện trong buồng tối.
28

Khi đã hoàn thành giai đoạn ủ phim với màng, phim sẽ được đem ra khỏi
cassette và ngâm trong dung dịch developer trong 5 phút. Sau đó, lấy phim ra và ngâm
trong dung dịch fixer khoảng 3 phút. Cuối cùng đem phim ra rửa dưới vòi nước sạch
và dùng kẹp treo lên giá làm khô ở nhiệt độ phòng.

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


- Cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối trong quá trình cấy và tăng sinh khối sợi
nấm. Nếu môi trường tăng sinh không bị nhiễm khuẩn thì sau khi ta thu sinh
khối là phần sợi nấm thì phần dịch còn lại trong và có màu vàng óng.
- Bước thu sinh khối không nên để sợi nấm quá khô, tốt nhất nên nghiễn sinh
khối nấm trong nitow lỏng ngay sau khi thu thí chất lượng DNA sẽ tốt hơn.
CT64 CT375 LA415 CT104 LA18 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72 KG216 KG531
CT80 LA9 CT178 AG518 TG24 CT72 CT375 KG535 KG483 CT72 KG398 CT74 CT64 KG398 KG531 CT63 LA2

30

- Thao tác phải nhẹ nhàng trong khi ly trích, dặc biệt là sau khi thêm hỗn hợp
phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), chỉ nên nghiêng ống nghiệm (hoặc
eppendorf) một cách cẩn thận không nên lắc mạnh.
- Thu phần dịch nổi không nên hút phần cặn phía dưới, đặc biệt là không
được hút vào phenol phía dưới. Phenol có thể phá hủy DNA sau khi ly trích.
- Khi thêm isopropanol (ethanol 100%) thì ta nên ủ trong tủ -20
0
C trong 30-
60 phút, để DNA có thể tủa hoàn toàn.
- DNA phải được rửa nhiều lần với ethanol 70% để loại bỏ bớt tạp chất và
nên làm khô DNA hoàn toàn (có thể để trong tủ cấy qua đêm).
- Khi điện di DNA tổng số thì nồng độ gel từ 0,6-0,8% là phù hợp.
Tuy nhiên, để đảm bảo cho phản ứng cắt và phản ứng lai xảy ra tốt hoặc biết
được nguyên nhân nếu phản ứng không cho kết quả tốt, tôi cố gắng hoàn thiện tốt từng
giai đoạn. Sản phẩm ly trích còn nhiều tạp nhiễm, do đó tôi tiến hành loại bỏ tạp
nhiễm bằng RNAse.
Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi đƣợc xử lý với RNAse.

Kết quả cho thấy quá trình biến nạp thành công và vi khuẩn chứa plasmid có
thể sống trong môi trường kháng sinh (70 g/ml). Các mẫu 2,4,6 là mẫu plasmid chuẩn
được cung cấp để thực hiện biến nạp, mẫu 1, 3 là mẫu plasmid được ly trích trong đó
có sử dụng RNAse, mẫu 5 không sử dụng enzyme RNAse trong quá trình ly trích nên
còn lẫn tạp chất nhiều. Kết quả ly trích không có lẫn DNA genomic của vi khuẩn.
1 2 3 4 5 6
32

Riêng mẫu 4 và 5 có hai băng, nguyên nhân là do plasmid tồn tại ở hai dạng: dạng
vòng và dạng xoắn.
4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea bằng enzym cắt giới hạn
Trong 30 dòng nấm Magnaporthe grisea ly trích được, tôi chọn ra 10 dòng để
thực hiện phản ứng cắt với hai enzym BamHI và EcoRV, nhằm chuẩn bị mẫu cho phản
ứng lai. Tôi thực hiện phản ứng cắt với thể tích là 40µl, nồng độ mẫu DNA được cắt là
2 µg, ủ ở 37
0
C qua đêm. Sau đó, hút 4 µl sản phẩm cắt và điện di kiểm tra trên gel
agarose 0,8%, kết quả điện di như sau: a) b)
Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn.
Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%, trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế
50V, thời gian 1 giờ. Hình a) các mẫu DNA được cắt bằng enzyme BamHI, hình b) các
mẫu DNA được cắt bằng EcoRV. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4),
VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9).


Sản phẩm lai xuất hiện trên nền phim sau khi rửa. Đây là kết quả của sự bắt cặp
giữa probe đánh dấu với DNA plasmid và DNA genomic của nấm M.grisea sau khi ly
trích. Các mẫu DNA được cắt bằng 2 enzyme BamHI và EcoRV thì sự bắt cặp với
probe không xảy ra. Kết quả này chứng minh được DNA được biến tính hoàn toàn trên
gel và có thể bắt cặp được với probe đánh dấu, nhiệt độ lai là 55
0
C, thời gian lai là 16
giờ thì probe đã bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu, nhưng không đặc hiệu. Điều này
có thể chứng tỏ rằng nhiệt độ lai thấp. Tuy nhiên, các mẫu sử dụng làm thí nghiệm thì
không có hiện tượng bắt cặp. Điều này có thể được lý giải từ những nguyên nhân sau:
- Phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn chưa hoàn chỉnh.
34

- Quá trình chuyển DNA lên màng chưa hoàn toàn do nồng độ gel cao và
kích thước gel dày (0,7cm), cũng có thể do kích thước DNA lớn nên khó
chuyển lên màng.
- Trình tự DNA mục tiêu hiện diện trên màng ít, probe không thể phát
hiện được.
- Sự liên kết giữa trình tự DNA mục tiêu với probe đánh dấu lỏng lẻo, nên
trong quá trình rửa màng, probe đã bị cuốn trôi theo dung dịch rửa. Thí nghiệm 2: Lai ở 60
0
C, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút
Tôi thực hiện phản ứng lai với các mẫu LA415 (1), LA18 (2), VL265 (3), VL
37 (4), VL 52 (5), VL45 (6), AG 518 (7), TG24 (8), KG535 (9) được cắt bằng hai
enzyme BamH I và Eco RV. Khắc phục những nguyên nhân nêu ở thí nghiệm 1 tôi
thực hiện các bước có cải tiến. 30 µl mẫu được load vào giếng trên miếng gel kích
thước 20 x 15 x 0,5 cm, điện di được thực hiện trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50

bắt cặp của DNA mục tiêu với probe. Các băng điện di không thẳng do điện cực ở máy
điện di không ổn định trong quá trình điện di hoặc do bồn điện di bị rung trong quá
trình điện di. Trong điều kiện này, kết quả điện di tạo mẫu lai không phản ánh thực
được sự di chuyển theo kích thước của các đoạn DNA từ đó kết quả phản ứng lai
không có ý nghĩa khi phân tích sự đa dạng. Những kết luận rút ra được là :
- Sản phẩm cắt phải có nồng độ đều nhau.
- Sản phẩm cắt phải tạo thành một vết sáng đêu trên gel sau khi điện di
(smear) thì mới có thể dùng làm mẫu cho phản ứng lai.
- Hiệu điện thế không nên quá cao có thể chạy ở 30V trong thời gian khoảng
32 h (Le Dinh Don, 2000).
- Nồng độ gel từ 0,7-0,8% là phù hợp để DNA có thể được chuyển lên màng
sau khi điện di.
- Dung dịch đệm điện di phải sạch thì mới đảm bảo quá trình chuyển lên
màng thành công.

36 Hình 4.6. Kết quả phát hiện trên X-ray film.
Kết quả lai với probe pMGY-SB, Lai ở 55
o
C, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút.
Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện thế 50V,
thời gian 5 giờ, trong đệm TAE 0,5X. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4),
VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)).

Quy trình thực hiện tuy có cải tiến nhưng kết quả không thay đổi nhiều. Tất cả
những mẫu lai được cắt bằng hai enzym cắt BamHI và EcoRV sau khi chuyển lên
màng, lai với probe và đều cho kết quả âm tính khi phát hiện trên X-ray film. Mẫu đối
chứng dương là những sản phẩm có kích thước nhỏ và đều chứa trình tự bổ sung với 3. Chuyển lên màng.
4. thực hiện phản ứng lai.
3. DNA chuyển lên màng
không hoàn toàn, và khó
gắn kết lên màng.

4. Lai không chuyên biệt,
bắt cặp không hoàn toàn.
điện di trong đệm TBE
1X để sự phân tách DNA
được tốt hơn.
3. Thực hiện điện di trong
gel nồng độ thấp và độ
dày nhỏ hơn 0,5 cm. Có
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận
Những nội dung thực hiện đưa ra tôi đã hoàn thành được những nội dung sau:
- Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea, DNA ly trích có
thể được sử dụng cho phản ứng lai.
- Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn tốt.
- Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5 .
- Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn.
- Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid pMGY-SB thành công cho phản ứng lai.
- Tạo mẫu cho quá trình lai tuy hoàn thành nhưng chưa thực hiện tốt và cần
phải có nhiều cải tiến.

sinh trên sâu hại cây trồng bằng kỹ thuật PCR. Luận án thạc sĩ. Trường Đại Học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
6. Võ Thị Thu Oanh, 2000. Bệnh Cây Chuyên Khoa. Khoa Nông Học- Đại Học
Nông Lâm TP. HCM.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
7. Derek Robinson, Paul R.Walsh, and Joseph A. Bonventre, 2001. Molecular
Biology Problem Solver: A Laboratory Guide. Wiley-Liss, Inc, p 224-244.
8. Hitoshi Nakayashiki, Kanako Kiyotomi, Yukio Tosa, and Shigeyuki Mayama,
1999. Transposition of the Retrotransposon MAGGY in Heterologous Species of
Filamentous Fungi. Laboratory of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Kobe
University, Kobe 657-8501, Japan.
9. Hamer JE, Farral L, Orbach MJ, Valent B, Chumley FG, 1989. Host specie-
specific conservation of a family of repeat DNA sequences in the genome of a
fungal plant pathogen. Proc Nat Acad Sci USA 86: 9981-9985)
10. Jose Romao and John E. Hamer, 1992. Genetic organization of repeated DNA
sequence family in the rice.department ò Biological Sciences, Purdue
University, West Lafayette.
11. Le Dinh Don, 2000.DNA-fingerprinting Analysis and PCR-based Diagnosis of
the Population of Magnaporther grisea. The Graduate School of Science and
Technology Kobe University, pp 31-37.
12. Le Dinh Don,Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999.
Annals of the Phytopathological Scociety of Japan.
13. Motoaki Kusaba, Yukio Eto, Le Dinh Don, Natsuka Nishimoto, Yukio Tosa,
Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999. Genetic diversity in
Pyricularia isolates from varios Hosts Revealed by Polymorphisms of Nuclear
Ribosomal DNA and the Distribution of the MAGGY Retrostranposon. Annals
of the Phytopathological Society of Japan.
41

14. Sambrook Joseph and Rusell W.David, 2001. Molecular Cloning A Laboratory