BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 ĐẶNG TRẦN ANH THƢ
BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT
SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI
TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea
GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA
LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA: 2002 - 2006

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY


POPULATION STRUCTURE OF
Magnaporthe grisea EXAMINED INITIALLY
BY SOUTHERN BLOT GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY


Thầy Nguyễn Đức Sáng đã giúp đỡ tôi về hóa chất và vật liệu nghiên cứu
trong thời gian làm đề tài.
Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ
môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình
giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận.
Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi
trong thời gian thực tập.
CON THÀNH KÍNH BIẾT ƠN
Cha Mẹ, các em và người thân trong gia đình đã ủng hộ và hỗ trợ con về mặt vật
chất cũng như tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa học này.

TP Hồ Chí Minh tháng 8/2006
Đặng Trần Anh Thư

ii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN

ĐẶNG TRẦN ANH THƯ, Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng
08/2006. “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng
di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”.
Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐÔN
 Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP trên cở sở phương pháp
Southern blot và phân tích sự khác biệt về sự thay đổi cấu trúc gen dẫn đến
phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea.
 Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm
Magnaporthe grisea, làm cơ sở để đánh giá và có phương pháp phòng trị cho
phù hợp.
 Phƣơng pháp nghiên cứu:

1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu ........................................................................................ 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3
2.1. Sơ lược về cây lúa ......................................................................................... 3
2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) ................................................................. 3
2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa ......................................... 3
2.2.2. Triệu chứng bệnh của cây lúa bị bệnh cháy lá lúa .............................. 4
2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh ..................................................................... 5
2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh ........................................................................ 5
2.3. Phương pháp Southern blot ............................................................................ 6
2.4. Enzyme cắt giới hạn ....................................................................................... 7
2.5. Các phương pháp chuyển DNA lên màng ...................................................... 8
2.5.1. Phương pháp mao dẫn hướng lên ........................................................ 8
2.5.2. Phương pháp mao dẫn hướng xuống ................................................... 9
2.5.3. Phương pháp mao dẫn hai chiều ......................................................... 9
2.5.4. Phương pháp chuyển bằng điện .......................................................... 9
2.5.5. Phương pháp chuyển bằng chân không ............................................... 9
2.6. Probe đánh dấu sử dụng trong Southern Blot .............................................. 10
2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea .................................... 10
2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích
đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea ............................................ 12

iv
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 14
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ................................................................... 14
3.2. Đối Tượng khảo sát ...................................................................................... 15
3.3. Nội dung thực hiện ....................................................................................... 15
3.4. Vật liệu và hóa chất ...................................................................................... 16
3.4.1. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................ 16
3.4.2. Hóa chất ............................................................................................. 16

vi khuẩn E.coli DH5α ............................................................................ 30
4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea
bằng enzym cắt giới hạn ...................................................................... 31
4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi được cắt bằng
EcoRV và BamHI với probe SB ......................................................... 33
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 38
5.1. Kết luận ....................................................................................................... 38
5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 38
TÀI NIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 49

TAE: Tris Acetate EDTA
TBE: Tris-base Boric EDTA
UV: Ultraviolet (light)
w/v: Weight for volume vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b) ................... 4
Hình 2.2. Bào tử nấm M. grisea chụp dưới kính hiển vi ........................................ 5
Hình 2.3. Vòng đời của nấm M. grisea ................................................................... 6
Hình 2.4: Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY ................................................ 10
Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea .......................................................... 28
Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi được xử lý với RNAse .... 30
Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8 ............................ 31
Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số
bằng enzyme giới hạn ........................................................................... .32
Hình 4.5. Kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai ................................... 34

Bảng 2.1. Các enzym cắt thông dụng……………………………………………. ... 7
Bảng 3.1. Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai…………. .. ..16
Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl…………………. . ..23
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl……… …23
Bảng 4.1. Những khó khăn và những giải pháp khắc phục
trong thực hiện phản ứng lai Southern ……………………………… …36

1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

5.3. Đặt vấn đề
Magnaporthe grisea (Hebert) Barr. (anamorph, Pyricularia. grisea (Cooke)
Sacc.) là nguyên nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật thuộc họ Gramineae,
Cannaceae, Cyperaceae và Zingiberaceae [12]. Đặc biệt, loại nấm này là nguyên nhân

grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”, nhằm phân tích được cấu trúc di truyền
giữa các dòng nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở các tỉnh
đồng bằng Sông Cửu Long.
5.4. Mục đích – Yêu cầu
5.4.1. Mục đích
Bước đầu phân tích đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh
đạo ôn bằng phương pháp Southern blot.
5.4.2. Yêu cầu
- Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm Magnaporthe grisea.
- Ly trích DNA các dòng nấm Magnaporthe grisea.
- Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt DNA genome bằng các enzyme giới hạn.
- Tạo được phân tử probe đánh dấu từ DNA plasmid.
- Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray. 3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24% trong tổng thất thu do sâu, bệnh, bão lũ.
Bệnh có thể làm mất trắng như ở Hà Đông (Việt Nam). Đối với bệnh thối cổ gié, ước
tính cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỉ lệ hạt kém phẩm chất gia
tăng 5%. Ở Miền Bắc, các vùng Hải Phòng, Thái Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang, Hà
Đông bị thiệt hại nặng. Ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng năm thường có hai cao
điểm của bệnh là tháng 11-12 dương lịch và tháng 5-6 dương lịch. Các huyện Châu
Thành, Chợ Gạo, Cai Lậy, Chợ Mới (An Giang), Thạnh Trị (Cần Thơ) là những nơi
thường có bệnh [6].
2.2.2. Triệu chứng bệnh cháy lá trên cây lúa
Bệnh cháy lá lúa là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa, còn được gọi là
bệnh đạo ôn. Khi dịch cháy lá xảy ra trên diện rộng thì năng suất và sản lượng sẽ giảm
rất rõ và thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế. Tác nhân gây bệnh có thể tấn công mọi
giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo xạ cho đến trước trổ
thì gọi là bệnh cháy lá. Bệnh có thể gây hại trên cổ lá nên gọi là thối cổ lá, hoặc gây
hại trên cổ bông nên được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem
vỏ hạt lúa.

a) b)
Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên
lá lúa (a) và trên cổ bông (b).
Nguồn: http//:aesrg.tamu.edu/Ricerice.htm

Trên mạ: vết bệnh có hình thoi nhỏ, màu hồng hoặc nâu vàng. Bệnh nặng, từng
đám vết bệnh liên kết kế tiếp nhau tạo thành những mảng cháy khô trên lá và thân làm
cho cây mạ khô héo dần rồi chết.
5

Trên lá: vết bệnh hình thoi màu nâu nhạt, rộng ở phần giữa và nhọn ở hai đầu,
giữa vết bệnh có màu xám tro, xung quanh nâu đậm, vòng ngoài cũng có màu nâu

14
N
2
O
3
). Các độc tố này ức chế sự phát triển của cây mạ và sự nảy
mầm của bào tử nấm làm cây bệnh tạo và tập trung chất coumain khiến cây lúa bị lùn.

Hình 2.2. Bào tử nấm Magnaporthe grisea chụp dƣới kính hiển vi.
(Nguồn:

6 Hình 2.3. Vòng đời của nấm Magnaporthe grisea.
(Nguồn: http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_
Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm)

2.3. Phƣơng pháp Southern blot
Southern blot (Southern 1975) là phương pháp để kiểm tra sự hiện diện của một
đoạn gen nào đó trong genome, với sự chính xác và độ đặc hiệu cao. Đầu tiên cần tách
chiết DNA bộ gen của tế bào, sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành
các đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách các đoạn DNA theo kích thước. DNA
được biến tính trên gel bằng dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5 M; NaCl 1,5 M),
sau đó chuyển các đoạn DNA từ bản gel lên màng lai bằng lực mao dẫn (màng lai
thường sử dụng là màng nilon hoặc nitrocellulose). Vị trí của các đoạn DNA trên gel,
được giữ yên khi chuyển lên màng lai.
Sử dụng các phân tử probe có đánh dấu phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng
xạ lai với các đoạn DNA trên màng lai, tạo nên các phân tử DNA lai. Tiến hành lai
phân tử bằng cách cho vào hộp lai chuyên dụng một lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai,

thuật DNA tái tổ hợp (recombinant).
Các enzyme này được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950. Nó bao
gồm một phần của tính chất giới hạn (restriction) viết tắt R, và một phần của tính chất
cải tiến (modification) viết tắt là M. Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp nó bảo vệ
chống lại sự xâm nhập của thực khuẩn thể, và những nhân tố di truyền lạ. Hệ thống R-
M của vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật tiền nhân (prokaryote)
như là một hệ thống miễn dịch [7].
Bảng 2.1. Các enzym cắt thông dụng.
Enzyme Chuỗi mã di truyền bị tác động
BamHI
BglII
EcoRI
HindIII
HpaI
KpnI
PstI
SmaI
SacI
SalI
AluI
Taq
G/GATCC
A/GATCT
G/AATTC
A/AGCTT
GTT/AAC
GGTAC/C
CTGCA/G
CCC/GGG
GAGCT/C

được chuyển bằng hệ thống hướng lên. Sự cải tiến này có hiệu quả khi thực hiện sự di
chuyển những đoạn phân DNA thông qua gel [14].
2.5.3. Phƣơng pháp mao dẫn hai chiều
Khi những đoạn trình tự đích hiện diện ở nồng độ cao thì phương pháp mao dẫn
được sử dụng vận chuyển DNA đồng thời (hiện tượng mao dẫn hướng lên và hướng
xuống) và nhanh từ một gel đơn đến hai màng nitrocellulose hoặc nylon. Đệm chuyển
là dung dịch đệm có trong gel và hiệu quả vận chuyển kém. Không dùng phương pháp
9

này đối với những thử nghiệm đòi hỏi tính nhạy cao. Tuy nhiên, phương pháp này có
thể được sử dụng để phân tích plasmid, acteriophages, hoặc cosmid 235 [14].
2.5.4. Phƣơng pháp chuyển bằng điện
Theo phương pháp này, những phân đoạn DNA sẽ di chuyển từ gel đến màng
lai thông qua dòng điện. Dung dịch đệm đóng vai trò lưu dẫn dòng điện. Do sự điện
giải, tính dẫn điện của dung dịch giảm dần, vì thế cần sử dụng một lượng dung dịch
đệm thích hợp để dòng điện luôn ổn định trong khi chuyển. Tốc độ chuyển phụ thuộc
vào kích thước đoạn DNA, nồng độ gel và hiệu điện thế dòng điện [14].
2.5.5. Phƣơng pháp chuyển bằng chân không
Phương pháp này tương tự phương pháp mao dẫn. Buồng chân không sẽ kéo
dung dịch chuyển xuyên qua gel và màng, DNA từ gel sẽ di chuyển theo sự di chuyển
của dung dịch đệm đến màng. So với phương pháp mao dẫn, phương pháp này nhanh
và hiệu quả hơn [14].
2.6. Probe đánh dấu đƣợc sử dụng trong Southern blot
Probe là những đoạn acid nucleic (DNA, RNA hoặc oligonucletide) đã biết rõ trình
tự và kích thước, dùng để định vị các đoạn acid nucleic cần nghiên cứu có trình tự bổ
sung với trình tự của probe, qua một phản ứng chuyên biệt gọi là lai phân tử. Probe có
độ đặc hiệu cao, do đó nó có thể phát hiện ra đoạn gen cần tìm trong hàng ngàn đoạn
DNA hoặc RNA khác nhau. Có hai hệ thống đánh dấu probe. Hệ thống đánh dấu
(labeling) bằng chất đồng vị phóng xạ như
32

polymerase RNA III và không có gen RT. Sự biểu hiện của các transposon trong vi
sinh vật luôn được quy định hoàn toàn bởi genome kí chủ. Nhưng hoạt tính của chúng
lại rất khác nhau tùy theo điều kiện xử lý: shock nhiệt, chiếu tia UV, nuôi cấy mô, lai
và chủng với vi khuẩn hoặc xử lý với những yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [17].
M. grisea là một loại nấm có phổ kí chủ rất rộng, chúng có thể kí sinh trên hơn 50
loại thực vật thân cỏ và một số loài cây 1 lá mầm khác [11]. Loại nấm này phân hóa và gồm
một số loại tác nhân gây bệnh chuyên biệt cho kí chủ. Tác nhân Oryza gây bệnh cho cây lúa
(Oriza sativa), Setaria gây bệnh trên loài kê đuôi cáo (Setaria italica), Panicum gây bệnh
trên loài kê thường (Panicum miliaceum), Triticum là tác nhân gây bệnh trên lúa mì
(Triticum aesticum), Eleusine là tác nhân gây bệnh trên kê hình ngón tay (Eleusine
coracana) và digitaria tác nhân gây bệnh trên loài cỏ crabgrass (Digitaria sanguinalis) [17].

Hình 2.4. Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY .
Các phân đoạn của nó pMGY18, pMGY23 (dòng kẻ đậm) và probe SB (bằng dòng kẻ trắng)
để đánh giá số lượng bản sao của MAGGY trong genome. Tên viết tắt của các enzym cắt:
BamHI (B), EcoRV (E), HindIII (H), PstI (P), SalI (S).(Yukio Tosa và ctv, 1995).
11

Genome M. grisea có 6 nhiễm sắc thể, có trọng lượng phân tử là 38 megabase
và kích thước mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau. Có nhiều transposon được tìm thấy
trong genome của M. grisea tạo nên những trình tự DNA lập lại được gọi là MGR (M.
grisea repeat), các MGR này giúp phân biệt các cá thể trong một quần thể nấm M.
grisea đa hình. Một số MGR được tìm thấy trong quần thể nấm M. grisea: MGR583,
MGR586, MGSR1, Grasshopper, MAGGY, Fosburi và Pot2 [9, 16]. Nhóm I gồm các
retrotransposon LTR Grasshopper, MAGGY và fosbury, retrotransposon MGR583-
LINE, yếu tố MGSR1-SINE và Mg-SINE, nhóm II gồm MGR586 hoặc Pot3 và Pot2.
MGR583 được cho là những yếu tố cũ, đã xuất hiện rất sớm trong quần thể M. grisea
trong quá trình tiến hóa của nó, LTR-retrotransposon MAGGY và Grasshopper thì bị
giới hạn, và được cho là những yếu tố mới cái mà gần đây mới xuất hiện trong quần
thể nấm Pyricularia bằng sự di chuyển ngang. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng

chỉ ra rằng vị trí của các MGR586 được phân bố một cách ngẫu nhiên trong genome
của nấm M. grisea.
Yukio Tosa và ctv (1995) đã sử dụng hai probe pMGY23 và pMGY18 được
tách dòng từ MAGGY, để phân tích sự phân bố của retrootransposon MAGGY trong
các dòng Pyricularia được phân lập từ các loài thực vật một lá mầm ở nhiều nước
khác nhau. Kết quả ông đã tìm thấy được nhiều bản sao của MAGGY trong các nòi
phân lập từ lúa và kê đuôi cáo (Setaria italica). Điều này chứng tỏ các nòi là tác nhân
gây bệnh trên lúa có quan hệ di truyền gần với nòi từ loài Setaria.
Pradeep Kachroo và ctv (1995) sử dụng phương pháp Southern blot với probe
Mg-SINE, phân tích genome của các nòi M. grisea. Qua nghiên cứu Kachroo đã phát
hiện ra khoảng 100 bản sao của Mg-SINE trên một thể đơn bội trong cả các nòi gây
bệnh cho lúa và các nòi không gây bệnh cho lúa.
Verel Shull và John E. Hamer (1996) sử dụng probe pCB586 để phát hiện đoạn
MGR586 trong quần thể nấm M. grisea. Phân tích sự giảm phân của MGR586 Shull
và Hamer đã tìm ra được một đa hình mới là MGR586-P2. P2 được tạo ra do một đoạn
chèn gần, đó là một retrotransposon chứa đoạn LTR. Kết quả các ông đưa ra rằng
những vị trí DNA đánh dấu có thể siêu biến tái sắp xếp chính xác.
Le Dinh Don và ctv (1998) phân tích cấu trúc quần thể nấm M. grisea ở Nhật
Bản bằng phương pháp DNA fingerprinting. Don đã sử dụng Probe SB lai với
MAGGY và MGR586. Kết quả đã cho thấy rằng có hai dòng liên kết trong quần thể
nấm, hai dòng này chỉ ra khả năng gây độc tương tự nhau. MAGGY thể hiện trong các
nhóm cũng tương tự như MGR586, mặc dù hai yếu tố nay khác nhau về tính chất và
13

cấu trúc. Điều này cho thấy rằng MAGGY có thể thay thế cho MGR586 trong những
nghiên cứu khác trong quần thể các nòi M. grisea gây bệnh cho lúa.
Le Dinh Don và ctv (1999) đã tiến hành phân tích cấu trúc di truyền của quần
thể nấm M. grisea gây bệnh đạo ôn trên vùng Đồng bằng Sông Hồng (1998) và Đồng
bằng Sông Cửu Long (1996). Ứng dụng phương pháp Southern blot sử dụng probe
chứa một đoạn phân lập từ MAGGY và đã phát hiện được 5 dòng chứa đoạn gen

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành
3.1.1. Thời gian
Đề tài được tiến hành từ 06-02-2006 đến ngày 15-08-2006.
3.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông Học, Đại Học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Phòng công nghệ sinh học, trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại
Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Đối Tƣợng khảo sát
Các dòng nấm Magnaporthe grisea được cung cấp từ Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long.
3.3. Nội dung thực hiện
- Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea.
- Thiết lập phản ứng cắt DNA genome bằng enzyme cắt giới hạn.
- Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5 .
- Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn.
- Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid.
- Tạo mẫu lai trên DNA genome của nấm M. grisea.
- Thực hiện lai Southern với probe palsmid pMGY-SB được đánh dấu bằng
biotin
3.4. Vật liệu và hóa chất
3.4.1. Dụng cụ và thiết bị
3.4.1.1. Dụng cụ
- Micropipette (0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl), đầu tip các loại
- Eppendorf 1,5 ml, 200 µl, ống ly tâm 15 ml