BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 ĐẶNG TRẦN ANH THƢ
BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT
SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI
TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea
GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA
LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA: 2002 - 2006

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY


POPULATION STRUCTURE OF
Magnaporthe grisea EXAMINED INITIALLY
BY SOUTHERN BLOT GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY


Thầy Nguyễn Đức Sáng đã giúp đỡ tôi về hóa chất và vật liệu nghiên cứu
trong thời gian làm đề tài.
Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ
môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình
giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận.
Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi
trong thời gian thực tập.
CON THÀNH KÍNH BIẾT ƠN
Cha Mẹ, các em và người thân trong gia đình đã ủng hộ và hỗ trợ con về mặt vật
chất cũng như tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa học này.

TP Hồ Chí Minh tháng 8/2006
Đặng Trần Anh Thư

ii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN

ĐẶNG TRẦN ANH THƯ, Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng
08/2006. “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng
di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”.
Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐÔN
 Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP trên cở sở phương pháp
Southern blot và phân tích sự khác biệt về sự thay đổi cấu trúc gen dẫn đến
phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea.
 Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm
Magnaporthe grisea, làm cơ sở để đánh giá và có phương pháp phòng trị cho
phù hợp.
 Phƣơng pháp nghiên cứu:

1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về cây lúa 3
2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) 3
2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa 3
2.2.2. Triệu chứng bệnh của cây lúa bị bệnh cháy lá lúa 4
2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh 5
2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh 5
2.3. Phương pháp Southern blot 6
2.4. Enzyme cắt giới hạn 7
2.5. Các phương pháp chuyển DNA lên màng 8
2.5.1. Phương pháp mao dẫn hướng lên 8
2.5.2. Phương pháp mao dẫn hướng xuống 9
2.5.3. Phương pháp mao dẫn hai chiều 9
2.5.4. Phương pháp chuyển bằng điện 9
2.5.5. Phương pháp chuyển bằng chân không 9
2.6. Probe đánh dấu sử dụng trong Southern Blot 10
2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea 10
2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích
đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea 12

iv
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 14
3.2. Đối Tượng khảo sát 15
3.3. Nội dung thực hiện 15
3.4. Vật liệu và hóa chất 16
3.4.1. Dụng cụ và thiết bị 16
3.4.2. Hóa chất 16

vi khuẩn E.coli DH5α 30
4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea
bằng enzym cắt giới hạn 31
4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi được cắt bằng
EcoRV và BamHI với probe SB 33
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38
5.1. Kết luận 38
5.2. Đề nghị 38
TÀI NIỆU THAM KHẢO 49

TAE: Tris Acetate EDTA
TBE: Tris-base Boric EDTA
UV: Ultraviolet (light)
w/v: Weight for volume vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b) 4
Hình 2.2. Bào tử nấm M. grisea chụp dưới kính hiển vi 5
Hình 2.3. Vòng đời của nấm M. grisea 6
Hình 2.4: Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY 10
Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea 28
Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi được xử lý với RNAse 30
Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8 31
Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số
bằng enzyme giới hạn .32
Hình 4.5. Kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai 34

Bảng 2.1. Các enzym cắt thông dụng……………………………………………. 7
Bảng 3.1. Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai…………. 16
Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl…………………. . 23
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl……… …23
Bảng 4.1. Những khó khăn và những giải pháp khắc phục
trong thực hiện phản ứng lai Southern ……………………………… …36

1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

5.3. Đặt vấn đề
Magnaporthe grisea (Hebert) Barr. (anamorph, Pyricularia. grisea (Cooke)
Sacc.) là nguyên nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật thuộc họ Gramineae,
Cannaceae, Cyperaceae và Zingiberaceae [12]. Đặc biệt, loại nấm này là nguyên nhân

grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”, nhằm phân tích được cấu trúc di truyền
giữa các dòng nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở các tỉnh
đồng bằng Sông Cửu Long.
5.4. Mục đích – Yêu cầu
5.4.1. Mục đích
Bước đầu phân tích đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh
đạo ôn bằng phương pháp Southern blot.
5.4.2. Yêu cầu
- Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm Magnaporthe grisea.
- Ly trích DNA các dòng nấm Magnaporthe grisea.
- Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt DNA genome bằng các enzyme giới hạn.
- Tạo được phân tử probe đánh dấu từ DNA plasmid.
- Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray. 3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24% trong tổng thất thu do sâu, bệnh, bão lũ.
Bệnh có thể làm mất trắng như ở Hà Đông (Việt Nam). Đối với bệnh thối cổ gié, ước
tính cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỉ lệ hạt kém phẩm chất gia
tăng 5%. Ở Miền Bắc, các vùng Hải Phòng, Thái Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang, Hà
Đông bị thiệt hại nặng. Ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng năm thường có hai cao
điểm của bệnh là tháng 11-12 dương lịch và tháng 5-6 dương lịch. Các huyện Châu
Thành, Chợ Gạo, Cai Lậy, Chợ Mới (An Giang), Thạnh Trị (Cần Thơ) là những nơi
thường có bệnh [6].
2.2.2. Triệu chứng bệnh cháy lá trên cây lúa
Bệnh cháy lá lúa là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa, còn được gọi là
bệnh đạo ôn. Khi dịch cháy lá xảy ra trên diện rộng thì năng suất và sản lượng sẽ giảm
rất rõ và thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế. Tác nhân gây bệnh có thể tấn công mọi
giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo xạ cho đến trước trổ
thì gọi là bệnh cháy lá. Bệnh có thể gây hại trên cổ lá nên gọi là thối cổ lá, hoặc gây
hại trên cổ bông nên được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem
vỏ hạt lúa.

a) b)
Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên
lá lúa (a) và trên cổ bông (b).
Nguồn: http//:aesrg.tamu.edu/Ricerice.htm

Trên mạ: vết bệnh có hình thoi nhỏ, màu hồng hoặc nâu vàng. Bệnh nặng, từng
đám vết bệnh liên kết kế tiếp nhau tạo thành những mảng cháy khô trên lá và thân làm
cho cây mạ khô héo dần rồi chết.
5

Trên lá: vết bệnh hình thoi màu nâu nhạt, rộng ở phần giữa và nhọn ở hai đầu,
giữa vết bệnh có màu xám tro, xung quanh nâu đậm, vòng ngoài cũng có màu nâu

14
N
2
O
3
). Các độc tố này ức chế sự phát triển của cây mạ và sự nảy
mầm của bào tử nấm làm cây bệnh tạo và tập trung chất coumain khiến cây lúa bị lùn.

Hình 2.2. Bào tử nấm Magnaporthe grisea chụp dƣới kính hiển vi.
(Nguồn:

6 Hình 2.3. Vòng đời của nấm Magnaporthe grisea.
(Nguồn: http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_
Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm)

2.3. Phƣơng pháp Southern blot
Southern blot (Southern 1975) là phương pháp để kiểm tra sự hiện diện của một
đoạn gen nào đó trong genome, với sự chính xác và độ đặc hiệu cao. Đầu tiên cần tách
chiết DNA bộ gen của tế bào, sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành
các đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách các đoạn DNA theo kích thước. DNA
được biến tính trên gel bằng dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5 M; NaCl 1,5 M),
sau đó chuyển các đoạn DNA từ bản gel lên màng lai bằng lực mao dẫn (màng lai
thường sử dụng là màng nilon hoặc nitrocellulose). Vị trí của các đoạn DNA trên gel,
được giữ yên khi chuyển lên màng lai.
Sử dụng các phân tử probe có đánh dấu phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng
xạ lai với các đoạn DNA trên màng lai, tạo nên các phân tử DNA lai. Tiến hành lai
phân tử bằng cách cho vào hộp lai chuyên dụng một lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai,

thuật DNA tái tổ hợp (recombinant).
Các enzyme này được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950. Nó bao
gồm một phần của tính chất giới hạn (restriction) viết tắt R, và một phần của tính chất
cải tiến (modification) viết tắt là M. Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp nó bảo vệ
chống lại sự xâm nhập của thực khuẩn thể, và những nhân tố di truyền lạ. Hệ thống R-
M của vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật tiền nhân (prokaryote)
như là một hệ thống miễn dịch [7].
Bảng 2.1. Các enzym cắt thông dụng.
Enzyme
Chuỗi mã di truyền bị tác động
BamHI
BglII
EcoRI
HindIII
HpaI
KpnI
PstI
SmaI
SacI
SalI
AluI
Taq
G/GATCC
A/GATCT
G/AATTC
A/AGCTT
GTT/AAC
GGTAC/C
CTGCA/G
CCC/GGG