41

 Thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo
Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều
kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây
lan Hồ Điệp in vitro

Bước 1: Tăng sinh khối mô sẹo
Thí nghiệm 3a : môi trường đặc,
Thí nghiệm 3b : môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút),

Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức:

Nghiệm thức
Môi trƣờng
Nồng độ của TDZ (mg/l)
3.1(đối chứng)
VW
0
3.2
VW
0,1
3.3
VW
1,0
3.4
VW
2,0
3.5
VW
3,0

0
0
4.2
MS
30
0
4.3
MS
30
1
4.4
½MS
30
1
4.5
VW
0
0
4.6
VW
30
0
4.7
VW
30
1
4.8
½VW
30
1

30

Các chất khác : agar (8,6g/l) + đường (30g/l)

Dùng dao phẩu thuật tách rời các phôi hình tim.
Dùng pince cấy gắp các phôi cho vào môi trường tạo vỏ alginate. Dùng
pipette hút môi trường alginate có chứa phôi nhỏ vào dung dịch CaCl
2
.2H
2
O 100mM.
Sau 15 phút dùng pince cấy gắp hạt vào đĩa petri có nước cất vô trùng.
Rửa hạt bằng nước cất vô trùng làm sạch lượng CaCl
2
.2H
2
O còn sót lại bên
ngoài vỏ hạt.
Sau khi thực hiện xong giai đoạn tạo vỏ hạt nhân tạo, hạt được cấy vào môi
trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng).
Quan sát khả năng tái sinh thành cây con của hạt.

44

3.2.2.2 Chỉ tiêu theo dõi
 Thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB
_Thời gian hình thành mô sẹo (NSC): tính từ ngày cấy chuyền đến khi có 50%
mẫu cấy xuất hiện mô sẹo.
_Màu sắc của mô sẹo.
_Độ cứng của mô sẹo.

Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến
khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC)
2,4-D là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, còn BA là chất điều
hoà sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin. Sự kết hợp giữa 2 chất này ở một tỉ lệ thích
hợp sẽ giúp cho mẫu cấy có hiệu quả tạo mô sẹo rất cao.

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến thời gian hình
thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro

Nghiệm
thức
2,4D
(mg/l)
BA
(mg/l)
Thời gian
hình thành
mô sẹo (NSC)
Màu sắc của
mô sẹo
Độ cứng
của mô sẹo
1 (ĐC)
0
0
19.88
Trắng xanh
Xốp
2
0,01

1
20.00
Vàng xanh
Chắc
8
0,1
0.01
20.22
Vàng xanh
Chắc
9
0.1
0.1
19.44
Vàng xanh
Chắc
10
0.1
1
20.44
Vàng xanh
Chắc
11
1
0.01
20.44
Trắng xanh
Xốp
12
1

47

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình
thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC)

Nghiệm
thức
2,4D
(mg/l)
BA
(mg/l)
%mẫu cấy
hình thành
mô sẹo
%mẫu cấy
hình thành
mô sẹo + PLB
%mẫu
hình thành
PLB
%mẫu không

C
6.67
EF
24.44
E
4
1
0
68.89
B
11.11
E
8.89
DE
11.11
G
5
0
0.01
62.22
C
15.56
C
15.56
B
6.67
H
6
0
0.1

9
0.1
0.1
53.33
D
6.67
G
8.89
DE
31.11
D
10
0.1
1
42.22
F
11.11
E
8.89
DE
37.78
B
11
1
0.01
46.67
E
20.00
B
13.33

 Nhận xét:
Sau khoảng thời gian từ 30 – 45 ngày sau khi cấy, sự đáp ứng của mẫu cấy với
các loại môi trường đã có sự khác biệt rõ ràng.
Nghiệm thức 1 (đối chứng) có tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo thấp, vì ở môi trường
không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng, PLB có khuynh hướng tăng sinh tạo thêm
nhiều PLB mới.
48

Riêng nghiệm thức 13 có tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cũng rất thấp, mẫu cấy phát triển
yếu nên tỉ lệ mẫu chết và không phản ứng khá cao (64.45%).
Ở nghiệm thức 8 (2,4-D=0.1mg/l kết hợp BA=0.01mg/l) là môi trường có tỉ lệ
mẫu cấy tạo mô sẹo lớn nhất: 80% và đây cũng là môi trường có tỉ lệ mẫu chết và
không phản ứng ít nhất (4.44%).

 Kết luận sơ bộ
Ở nghiệm thức đối chứng, PLB cũng có khả năng tạo mô sẹo nhưng còn thấp,
chủ yếu là tăng sinh PLB hoặc mẫu không phản ứng.
Nghiệm thức 8 đạt tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất và tỉ lệ mẫu chết thấp nhất nên
thích hợp để tạo mô sẹo lan Hồ Điệp từ PLB.
Nghiệm thức 5 chứng tỏ việc sử dụng kết hợp 2,4-D và BA ở nồng độ cao cùng
lúc đã gây ức chế quá trình phát triển của mẫu cấy PLB lan Hồ Điệp.
Qua kết quả thu nhận được ở thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy:
 Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì từ protocorm sẽ phát triển thành
mô sẹo nhiều hơn và mô sẹo có màu trắng xốp, dễ vỡ.
 Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì khả năng hình thành mô sẹo sẽ
thấp, còn khả năng tăng sinh protocorm và tái sinh chồi tăng lên. Do đó mô sẹo thường
có màu vàng xanh và khá chắc.
 Ở môi trường mà tỉ lệ 2,4-D và BA quá cao thì mẫu rất dễ chết, khả năng tạo
mô sẹo thấp.


1 (ĐC)
0
0
0.00
B
2
20
100
21.11
A
3
20
150
20.89
A
4
20
200
19.89
A
5
40
100
21.11
A
6
40
150
20.22
A

Nghiệm
thức
Đƣờng
(g/l)
Nƣớc
dừa
(ml/l)
%mẫu cấy
hình thành
mô sẹo
%mẫu cấy
hình thành
mô sẹo + PLB
%mẫu
hình thành
PLB
%mẫu không
phản
ứng+mẫu chết
1 (ĐC)
0
0
0.00
F
0.00
G
71.11
A
28.89
A

B
17.78
C
5
40
100
64.44
BC
8.89
D
8.89
CD
17.78
C
6
40
150
55.56
D
11.11
C
8.89
CD
24.44
B
7
40
200
80.00
A

 Ghi chú:
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự
khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
 Nhận xét:
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình
thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro, 40 ngày sau cấy chúng tôi nhận
thấy, trừ nghiệm thức đối chứng, các nghiệm thức còn lại đều xuất hiện mô sẹo. Mô
sẹo ban đầu có màu trắng vàng xốp, sau đó chuyển sang màu vàng xanh và chắc.
Trong đó, nghiệm thức 7 (VW bổ sung 40g/l đường và 200ml/l nước dừa) có tỉ
lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cao nhất: 80% mẫu, có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với
nghiệm thức đối chứng: không có mẫu nào hình thành mô sẹo.
Ngoài ra, nghiệm thức đối chứng còn có tỉ lệ mẫu không phản ứng và mẫu chết
cao nhất (28.89%). Ngược lại, nghiệm thức 7 có tỉ lệ mẫu chết thấp nhất (4.44%).