1

1 Phần 1. Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề
Từ lâu hoa Lan đã được tôn vinh là “Mỹ Nữ Sơn Lâm” của các loài hoa, đây
không chỉ là một loại hoa vương giả có vẻ đẹp lộng lẫy, mê hồn mà còn tượng trưng
cho bản tính hướng thiện của con người.
Trong dân gian, đã lưu truyền nhiều câu chuyện có liên quan đến loài hoa này.
Người đầu tiên ca ngợi hoa Lan là đức Khổng Phu Tử (Trung Quốc - 551 B.C), ví hoa
Lan là loài hoa quân tử...Và trước đó nữa, vua Thần Nông (Trung Quốc - 2800 B.C)
đã dùng hoa Lan trị bệnh như là một liều thuốc tiên, nên từ đó dân gian đã âm thầm
gọi hoa Lan là vua của các loài hoa... Tương truyền nước ta cũng có kể rằng: khi vua
Trần Nhân Tông rời kinh thành về Yên Tử, Quảng Ninh trong đêm ngủ mộng Ngài
thấy có người đến yết kiến và dâng tặng một giò hoa rất đẹp. Sáng ra, nghi nghi hoặc
hoặc hoặc nhà vua đi sâu vào trong núi thì bắt gặp tại một khe sâu có một loài
hoa lạ, đẹp và vô cùng thuần khiết. Đời sau người ta gọi loài hoa này là lan Trần mộng
(giấc mộng của vua Trần) để chỉ điển tích rũ sạch bụi trần bước vào cõi thiền thuần
khiết của Ngài.
Do đó, thú chơi Lan mang một ý nghĩa rất đặc biệt, bởi khi chăm Lan người ta
không chỉ chăm chút cái đẹp cho hoa mà còn đang dưỡng một cái Tâm trong sáng cho
mình.
Ngày nay, chúng ta có thể thấy hoa lan ở khắp mọi nơi và dễ bị choáng ngợp
trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa muôn màu muôn vẻ của các loài lan như Cattleya, Hồ
Điệp , Dendrobium, Mokara, Vanda, Cymbidium, Oncidium.... Hoa lan được ưa
chuộng phải chăng bởi đó là biểu tượng của niềm khát khao cuộc sống phong lưu và
hạnh phúc bền bỉ.
Hoa lan là một món quà của tạo hóa, nó không chỉ là một loài hoa đẹp có giá trị
về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao và hiện đang có thị trường tiêu thụ mạnh
trong nước cũng như xuất khẩu.
Tại khu vực Đông Nam Á ngành hoa lan phát triển rất mạnh, Thái Lan là nước

mang lại, trong đề tài này chúng tôi thử nghiệm một phương pháp tạo phôi soma trên
cây hoa lan Hồ Điệp sao cho việc tạo phôi soma trở nên thật đơn giản và hiệu quả.
Từ kết quả thu nhận được trong việc tạo phôi soma cây lan Hồ Điệp, chúng tôi
đi xa hơn nữa, bằng cách sử dụng các phôi soma ấy để tạo hạt nhân tạo. Công nghệ hạt
3

nhân tạo là phương pháp tạo một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên, có một phôi sinh
dưỡng hoặc "chồi ngủ" được bọc trong một lớp dung dịch alginate (một chất có tác
dụng tạo lớp vỏ cứng bên ngoài cho mầm hạt) có chứa chất dinh dưỡng, phôi này sau
đó nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh. Đây là một vấn đề đang được các nhà khoa học
trên thế giới quan tâm trong ứng dụng bảo quản phôi vô tính, chất mầm thực vật dài
hạn. Đồng thời mở ra một hướng mới cho việc sử dụng những hạt vô tính thay cho các
hạt hữu tính có khả năng nẩy mầm thấp và không đồng loạt.
Khi thực hiện đề tài này, chúng tôi hy vọng sẽ mang đến những hiểu biết mới
về quá trình hình thành phôi vô tính trên cây lan Hồ Điệp nói riêng và hoa lan nói
chung, đồng thời đem lại những ứng dụng thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật
tại Việt Nam.

1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
- Tìm hiểu vai trò tác động của chất điều hòa sinh trưởng lên sự hình thành
mô sẹo cũng như phát sinh phôi soma của cây lan Hồ Điệp.
- Tạo hạt nhân tạo có ý nghĩa trong công tác duy trì nguồn mẫu, nguồn gen
thực vật quí hiếm trong một thời gian dài phục vụ cho những mục đích sử dụng khác
trong tương lai.
- Làm cơ sở cho việc kiểm chứng sự khác nhau giữa cây hoa lan Hồ Điệp in
vitro có nguồn gốc từ phôi soma với cây hoa lan Hồ Điệp từ các nguồn mô khác.
- Làm cơ sở để nghiên cứu tiếp khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma
của các loại cây thân thảo một lá mầm khác.


Cây phong lan Hồ Điệp có nguồn gốc ở Tây Nam Châu Á, trải rộng trên
những vùng núi cao ở Trung Quốc và Tây Tạng đến Châu Úc, trên vùng kinh tuyến
bao gồm giữa Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Người ta còn gặp giống này ở
Sumatra, Bornéo, Célèbes, Nouvelle Calédonie (Marry Noble, 1971).
Đây là những cây sống biểu sinh, trên những cây cao trong rừng dầy có ẩm độ
cao hoặc rất gần đất, trên những cây nhỡ (arbuter), hay sống bám trên những hốc đá,
hay trên những đám rêu dày, một vài loài sống ở vùng ven biển. Lan Hồ Điệp ít thích
hợp với nắng hơn so với những loại phong lan có giả hành. Nhiệt độ thích hợp cho sự
5

tăng trưởng và phát triển là 15
o
C – 38
o
C và giống này thường sống ở cao độ 200m-
400m (William và Kramer, 1983).
Tên Phalaenopsis có nguồn gốc từ Phalaina (phalène) và d’Opsis (apparence),
được Blume (nhà thực vật học người Hà Lan) đặt vào năm 1852 khi ông khám phá một loài
lan đặc biệt có hoa giống cánh bướm, đó là Phalaenopsis amabilis.
Đa số các tác giả đều đồng ý xếp chi Hồ Điệp có một nhụy, kiểu phát hoa bên và
có cấu tạo đơn trục. Trong chi này có khoảng 70 loài, được phân bố trong những vùng và
khu vực khác nhau. Các loài này thường xuyên lai chéo với nhau, do đó phả hệ của những
cây nhận được cũng rất phức tạp. Thế hệ con cháu của chúng cũng không thuần nhất. Tuy
nhiên sự lai tạo đưa đến một lợi ích lớn để cung cấp những cá thể luôn đổi mới và những
đặc tính quyến rũ của hoa (Perlz, 1974).

2.1.2 Vị trí lan Hồ Điệp trên thị trường
So với đa số các loại lan trên thị trường hiện nay, thì lan Hồ Điệp nổi bật hơn,
bởi các đặc tính của hoa đa dạng, màu sắc phong phú, hoa lâu tàn, trung bình hoa tươi
trên cành có thể kéo dài từ 3-4 tháng (Broly, 1982). Trục phát hoa dài, đường kính to,

bộ cơ thể.
Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để
chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin
di truyền của cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thỏa (cây một lá mầm) một lọai
cây khó thực hiện và ông bị thất bại.
Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã
lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ
của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh
trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn mặc dù
tác giả đã chuyển sang môi trường mới.
Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum
esculentum).
8

Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô
sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng.
Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh
trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất hích thích sinh trưởng nhân
tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Và năm
1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà
rốt
Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau đó các
chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện.
Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa
kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá.
Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơnđã được phát
triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh.
Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi
cấy túi phấn cây cà độc dược.
Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc

hiện đối với những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng. cây tái sinh từ
mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ
biến dị tế bào soma của phương pháp này rất cao.

 Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn
Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong máy lắc thì
khối sẹo dứơi tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều tế bào đơn lẻ gọi là tế bào
đơn. Những tế bào đơn này nuôi cấy trong môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối.
Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng tế bào đơn tách ra và đặt trải trong
môi trường thạch thì sẽ phát sinh thành những tế bào mô sẹo. Những tế bào mô sẹo
này được nuôi cấy trong môi trường cytokinin/auxin thích hợp thì sẽ tái sinh thành cây
hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta dựa vào phương pháp này để tạo ra
giống mới bằng cách đột biến tế bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ.

 Nuôi cấy protoplast- chuyển gen
Protoplast (tế bào trần ), thực chất là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức
sống và duy trì chức năng sẵn có. Protoplast có thể tái sinh trực tiếp từ thân, lá, rễ bằng
cơ học, hoặc từ những tế bào đơn sẵn có. Trong môi trường thích hợp các protoplast
10

có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Trong chọn giống cây trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây
trồng bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác loài.
Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính của một số
loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp chuyển gen khác.

 Nuôi cấy tế bào đơn bội
Hạt phấn của cây trồng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp tạo thành mô
sẹo, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh có bộ nhiễm sắc thể
n gọi là cây đơn bội. Trong nuôi cấy mô thực vật người ta sử dụng những mô sẹo này

pectin, …) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981).

(2) Cytokinin
Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần
Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein
(Vũ Văn Vụ và csv, 1993). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy
mô, những chất thường được dùng là Kinetin và BA (Benzyl Adenin).
Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm, làm tăng sự
nở hoa. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo
sinh trưởng (cals) trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bứu ở các cây gỗ lâu
năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991).
Cytokinin kích thích sự tổng hợp mới enzym Rubisco (Ribulozo-1,5-biphotphat
cacboxylaza/oxygenaza) hoặc ở mức sao chép (làm tăng hoạt tính ARN-polymeraza)
hoặc ở mức dịch mã (thành lập các polyriboxom) (Parthier, 1985). Ảnh hưởng của
Cytokinin thấy rõ khi phối hợp sử dụng với auxin (Meredith và csv, 1970). Skoog và
csv (1948) ghi nhận lượng benzyl amino purine cao có tác dụng kích thích sự tạo chồi,
đồng thời ức chế sự phân hóa tạo rễ.

12

 Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] [TDZ]

Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] là một hóa chất tổng hợp
dạng tinh thể thường tan trong ethanol và ít tan trong nước. Vào những năm 1970,
TDZ được sử dụng như một thương phẩm làm rụng lá phục vụ cho quá trình thu
hoạch bông vải. Đến gần đây, nó được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô do có hoạt
tính cytokinin và auxin mạnh hơn hẳn các cytokinin và auxin cơ bản thông dụng khác.

sinh phôi cao hơn so với các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác. Do tính
chất này của TDZ, nên ngoài hoạt tính của cytokinin đã được đề cập nhiều, người ta
cho rằng, TDZ có ảnh hưởng đến quá trình biến dưỡng auxin. Victor và csv (1999) đã
cũng cố cho giả thiết này bằng một khảo sát so sánh hoạt tính phát sinh hình thái của
BAP và TDZ trên cây đậu phộng, ghi nhận sự khác biệt trong hoạt tính là TDZ có khả
năng sinh phôi vô tính, trong BAP không có khả năng này.
- Nuôi cấy protoplast: TDZ kết hợp với auxin (NAA; 2,4-D; NOA) được sử
dụng trong giai đoạn hình thành vách tế bào xung quanh protoplast, khởi đầu cho sự
phân chia tế bào (Chupeau và csv, 1993; Reustle và csv, 1995) và trong giai đoạn tiếp
theo tái sinh từ mô sẹo có nguồn gốc protoplast (Lenzner và csv, 1995). Nhiều báo cáo
khác nhau cho thấy, TDZ ở nồng độ thấp có hiệu quả cao hơn hẳn so với các cytokinin
khác.
- Tạo chồi ngoài vườn ươm : Ngoài các tác dụng sinh chồi in vitro, TDZ còn
có tác dụng kích thích tạo chồi trên cây khi được phun hoặc xử lý vào đất trong vườn
ươm, chủ yếu là tạo chồi bất định từ rễ hoặc phần dưới thấp của cây.
Đi cùng với những ưu điểm trên, nhược điểm của TDZ cũng được ghi nhận,
bao gồm : thủy tinh hóa chồi tái sinh (Debergh và csv, 1992; Briggs và csv, 1988;
Causineu và Donnelly, 1991); biến dị hình dạng lá (van Niewkerk và csv, 1986;
Cambecedes và csv, 1991); chồi chặt và ngắn (Fasolo và csv, 1989; Meyer và van
Staden, 1988); sự khó khăn trong việc kéo dài và ra rễ chồi tái sinh.

14

2.3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon
Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không
quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung
cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân
chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là sucrose, d-glucose, d-
fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon được sử rụng rộng rãi
nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2%-12% hoặc cao hơn tùy thuộc

dụng ở nồng độ 6-10 g/lít, nồng độ agar tốt nhất cho sự phát triển của mô cấy là 8g/lít
(Ribeiro và csv, 2000).

2.3.6 Ảnh hưởng của các điều kiện vật lý
Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban
đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux. Nhưng
trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3.000-10.000 lux để kích
thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Dưới
cường độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhưng có tỷ lệ sống sót cao
khi chuyển sang môi trường đất. Chưa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi
trường cấy mô, nhưng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn néon huỳnh quang
là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài. Cấy phôi thường không sử dụng
ánh sáng đèn. Theo Scozzoli và Pasini, 1992; Pinto và csv, 1994, cấy phôi đào nên để
trong tối 14 ngày. Tương tự, ở cây bơ nên để 21 ngày trong tối ở nhiệt độ 21
0
C (Lano và
csv, 1995).
Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng
và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25-28
o
C
(Nguyễn Văn Uyển, 1993).

16

2.3 Nuôi cấy phát sinh mô sẹo
2.4.1 Sự hình thành mô sẹo

Hình 2.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp
Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định,

14
CO
2
bằng chu trình
Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 carbon (Yamada và csv, 1982).
Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính này
xảy ra do : độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có số
lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phần môi
trường nhất là hormon ( Trần Văn Minh, 2003).
Để tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất sinh trưởng, đôi khi
có dịch chiết (Trần Văn Minh, 2003). Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất
sinh trưởng thêm vào có khác nhau (Trần Văn Minh, 2003). Chất hormon thường tổ
hợp thành 4 nhóm :
(1) Auxin.
(2) Cytokinin.
(3) Auxin + Cytokinin.
(4) Dịch Chiết.
Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyền. Môi trường cấy chuyền
cũng giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất sinh trưởng được giảm nồng độ.
Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm mô
sẹo có trọng lượng là 20-100mg, thời gian giữa hai lần cấy chuyền là 20-30 ngày phụ
thuộc vào từng loại mô sẹo. Trong quá trình phát triển mô sẹo thường xuất hiện 2 loại
tế bào :
(1) Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng.
18

(2) Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc.
Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm. Ngoài ra,
nếu sau thời gian dài không cấy chuyền thì mô sẹo sẽ hoá nâu và chết.



Hình 2.4 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo

Sự hình thành chồi được điều khiển bằng hóa chất (Skoog, 1944). Theo Trần
Thanh Vân và Trinh (1978) sự hình thành chồi được điều khiển bằng :
- Tỷ lệ ctytokinin /auxin từ 10-100.
- Carbohydrate như sucrose và các chất hữu cơ như casein hydrolysate.
- Điều kiện nuôi cấy.
- Dịch chiết.
Tạo rễ cần auxin, đường, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng… (Gautheret, 1959).
Adenine sulfate có tác dụng cản trở auxin. GA
3
cản trở sinh tổng hợp và tích lũy hạt
tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi.
20

2.4 Phôi vô tính
2.5.1 Lịch sử nghiên cứu
Bắt đầu từ 1958, Street và Reinert đã mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế
bào đơn của cà rốt. Sau đó, vào 1977, Murashige đưa ra ý kiến tạo phôi vô tính có thể
trở thành biện pháp vi nhân giống. và tiếp tục cho đến nay thì công nghệ phôi vô tính
được xem là rất có triển vọng cho nông nghiệp thế kỷ 21. Hình 2.5 Phôi vô tính lan Hồ Điệp

2.5.2 Khái niệm về phôi vô tính
Phôi vô tính hay phôi soma là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt
nguồn từ các tế bào dinh dưỡng, bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh
gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ.

Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2
và 3, được nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống
nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979).
Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả
năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trường có auxin. Trong suốt giai đoạn này,
những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trường
nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1.
Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi
trường không có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dường
như không biệt hóa.
Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào,
dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu. Pha này được gọi là pha 2.
22

Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua
phôi hình tim và phôi hình thủy lôi.

Hình 2.6 Các giai đoạn phát sinh phôi vô tính
 Các kiểu phát sinh phôi soma
Sự phát sinh phôi soma bất định
Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của
một số loài thực vật nhiệt đới, các phôi bất định này có thể được tạo trực tiếp từ tế bào
đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này. Phương pháp
này được sử dụng trong chương trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn như cứu các
phôi bị chết non do lai tạo.
Sự phát sinh đa phôi vô tính
Hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần. Các
khối mô có khả năng tạo phôi cao khi được cấy chuyền sang môi trường mới sẽ phát
triển và tăng trưởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể được
phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và

nồng độ khác nhau cũng được sử dụng và đã cho thấy có nhiều ảnh hưởng đến cảm
ứng tạo phôi ở một số loài thực vật. Bên cạnh đó cũng đã có những đề nghị về vai trò
của nitrogen, amino acid, amid, cũng như của kali, photphat đến sự hình thành phôi(
Tisserat và cộng sự, 1979; Ammirato, 1983).

 Nguồn cacbohydrate
Sucrose là một nguồn cacbon chính trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên trong
một vài trường hợp, galactose (Cabasson và cộng sự, 1997), lactose (Jumin và Nato,
1995), maltose (Dhir và Yavada, 1995), glucose và fructose (Canhoto và Cruz, 1994)
24

và manitol (Kunitake và cộng sự, 1991) khi kết hợp với sucrose đã đẩy mạnh sự cảm
ứng tạo phôi cũng như sự phát sinh hình thái bình thường của phôi.

 Chất điều hòa tăng trưởng
Chất điều hòa tăng trưởng được chia làm 5 nhóm chính là auxin, cytokinin, acid
abscisic, gibberellin, ethylen. Các chất điều hòa tăng trưởng là tối cần thiết cho việc
cảm ứng tạo phôi và mỗi chất điều hòa tăng trưởng thì lại có những tác dụng lên việc
tạo phôi khác nhau trên những loài thực vật khác nhau và ở những nồng độ khác nhau.
Quá trình cảm ứng hình thành phôi vô tính ở những loài thực vật khác nhau cho thấy
có 3 kiểu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng đối với phôi:
1) Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng là cần thiết trong tất cả các giai
đoạn phát triển cuả phôi
2) Chất điều hòa tăng trưởng cần thiết trong giai đoạn cảm ứng, tuy nhiên, sang
đến giai đoạn phát triển cao hơn thì các chất điều hòa này cẩn phải được loại
bỏ
3) Sự hình thành phôi vô tính chỉ xuất hiện khi có sự có mặt của chất điều hòa
tăng trưởng, nhưng khi phôi vô tính phát triển sau giai đoạn hình cầu thì sự
có mặt của chất điều hòa không còn tác dụng nữa.
Chất điều hòa tăng trưởng là auxin, thường là 2,4-D và NAA được sử dụng

nhân tố quan trọng trong việc cảm ứng cũng như hình thành phôi vô tính một cách
bình thường. Khi mẫu cấy được chuyển sang môi trường không có nhân tố tăng
trưởng, một khoảng thời gian tối thiểu là 8 ngày rất cần thiết cho việc cảm ứng hình
thành phôi với một hiệu quả rất cao mà không cần quan tâm đến dạng chất điều hòa
tăng trưởng đã sử dụng.

 Sự tương quan gữa độ tuổi của mẫu cấy và sucrose
Thường thì độ tuổi (Wetzstein và cộng sự, 1989) hay giai đoạn phát triển của
mẫu cấy (Karunaratne và cộng sự, 1991) là một nhân tố quan trọng trong cảm ứng tạo
phôi. Do đó, sự phát triển tối đa hay độ tuổi sinh lý của mẫu cấy là một nhân tố chủ
yếu trongcảm ứng tạo phôi có hiệu quả ở một số loài thực vật. Hơn nữa, nguồn dinh
dưỡng cơ bản cần thiết (sucrose/cacbonhydrate) cho các loại mô thì khác nhau đáng kể
tùy vào độ tuồi phát triển (Monnier, 1990). Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng của các chất
kích thích tăng trưởng khác nhau đến các loại mô khác nhau thì phụ thuộc nhiều vào
nồgn độ sucrose có trong môi trường nuôi cấy (Thompson và Thorpe, 1987). Một