31
7
Mạt cưa cao su + cám bắp 10%
8
Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + super lân 5
o
/
oo
+ urê
2,5
o
/
oo

9
Mạt cưa cao su + urê 2,5
o
/
oo
+ DAP 2,5
o
/
oo

10
Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + dynamic lifter 2,5%.

Tổng số bịch cấy trong 3 lần: 390 bịch
Các chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi quá trình sinh trưởng và hình thành quả thể nấm
Linh chi đen


32
Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu
không có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm
phần 2.
- Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn
hợp gồm: chloroform:ethanol 95
o
:NH
4
OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường
phải có tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn.
Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1%
đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer,
Dragendorff.
3.5.1.2. Thuốc thử định tính alcaloid
- Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl
2
trong 60 ml nước cất và 5 gam KI
trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100
ml.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu
có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có
thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong
dung dịch thử.
- Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO
3
)
3
trong 25 ml

Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13)
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để
yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.
 Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ
bộ xác định là có saponin triterpenoid.
 Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ
xác định là có saponin steroid.
3.5.3. Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard)
Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nón, trong 10
– 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên
mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch
chiết ether.
Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5
ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào
1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H
2
SO
4
đậm đặc lên
thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2
lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển
thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid
3.5.4. Định tính acid hữu cơ
Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít
tinh thể natri Na
2
CO
3
. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na
2

Dịch chiết lần 2
-Ngâm nước 70
o
C
trong 3 giờ
-Ngâm trong nước
70
o
C trong 3 giờ
-Ngâm trong cồn 80%
ở 70
o
C trong 2 giờ 35
3.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excell. Tốc độ sinh
trưởng trung bình của hệ sợi nấm trên các môi trường được tính như sau:
X
i
= (x
1
+ x
2
+ x
3
+ … + x
i
)/n

hình dạng giống giọt dầu và kích thước bào tử dao động khá lớn 12 – 20 x 8 – 12 µm.

Hình 4.2: Cấu trúc bào tử nấm Amauroderma s ubresinosum (vật kính x100) 37
4.1.3. Hình thái quả thể nấm Amauroderma subresinosum

Mặt trên quả thể nấm Mặt dưới quả thể nấm
Hình 4.3: Hình thái quả thể nấm Amauroderma subresinosum đƣợc nuôi trồng

Quả thể nấm Amauroderma subresinosum có dạng hình quạt hay gần tròn hoặc
ít nhiều dị dạng. Ở giai đoạn mầm nấm có dạng hình tròn, màu trắng. Sau khoảng 20 –
25 ngày, mầm nấm hình tròn chuyển sang hình quạt và lớp sắc tố nâu – đen bắt đầu
hình thành xung quanh cuống nấm. Phía ngoài cùng rìa của quả thể nấm có màu trắng
- đục, dày và sau khoảng 30 -40 ngày tiếp theo thì lớp rìa trắng chuyển sang màu đen -
quế, lúc này quả thể đã già. Trên mặt mũ nấm có vân gợn đồng tâm và những rãnh nhỏ
lồi lõm nhấp nhô không đồng nhất. Mũ nấm rộng 6 – 12 cm, dày 1 – 2 cm, đôi khi có
vài mũ nhỏ phát triển từ 1 gốc chung. Mặt trên mũ có lớp vỏ cứng màu đen bóng, gồ
lên trên, láng bóng như verni. Mép mũ thường dày, uốn lượng cong vào có các nếp
gấp và các khía răng cưa. Bề mặt trên quả thể màu nâu quế, màu gỗ sẫm, nâu sẫm. Mặt
dưới quả thể nấm là lớp bào tầng chứa rất nhiều lỗ nhỏ, màu trắng đục và dày cỡ 4 – 6
ống/mm. Chính những lỗ nhỏ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành.
4.2. Sự sinh trƣởng và phát triển nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum)
4.2.1. Tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi
trƣờng thạch
Trên môi trường thạch, hệ sợi nấm Linh chi đen phát triển dưới dạng hình rễ
khá sớm và tốc độ tương đối nhanh. Trong quá trình theo dõi sự sinh trưởng của hệ sợi
nấm Linh chi đen, chúng tôi nhận thấy trong 2 ngày đầu hệ sợi tăng trưởng rất chậm.
Sau 3 ngày thì trên môi trường PGA và PGA bổ sung đều xuất hiện lớp sắc tố màu đỏ

Đường kính colonie (cm)
PGA
2
4
2,418 ± 0,151
6,441 ± 0,18
PGA + 10% nước dừa
già
2
4
2,732 ± 0,168
6,832 ± 0,19
PGA + 10% dịch
chiết nước cà rốt
2
4
2,9 ± 0,227
7,823 ± 0,156

39
Mizuno
2
4
1,673 ± 0,072
3,164 ± 0,107
Czapek - Dox
2
4
2,268 ± 0,113
5,46 ± 0,174

4.2.

40
Bảng 4.2: Tốc độ lan sâu của hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên
môi trƣờng nhân giống
Thờigian
(ngày)
Tốc độ lan sâu xuống đáy ống nghiệm (cm)
MT1
MT2
MT3
MT4
6
4,818 ± 0,199
5,372 ± 0,127
3,964 ± 0,169
4,782 ± 0,209
9
7,95 ± 0,165
8,745 ± 0,246
7,01 ± 0,191
7,827 ± 0,22
12
11,4 ± 0,167
11,782 ± 0,232
10,309 ± 0,197
10,845 ± 0,163

0
2