- 19 - Bảng 2.5 Thành phần đa lượng trong môi trường C
Tên chất
Khối lượng (g) pha cho 300 lít
KH
2
PO
4
KNO
3
Ca(NO
3
)
2
MgSO
4

52,680
193,938
265,050
121,680 Bảng 2.6 Thành phần vi lượng trong môi trường C
Tên chất
Khối lượng pha 1 lít Stock
Fe
FeSO
4

CoSO
4
. 6H
2
O
KI
0,05 g
25 g
35 g
4,065 g
2,864 g
0,400 g
0,900 g
0,126 g
0,100 g
0,500 g
Sau khi pha stock ta lấy ra 300 ml dòch dung stock, pha cho 300 lít dung dòch dinh
dưỡng.
2.2.2.2 Thiết lập hệ thống trồng cây cà chua
ng dụng phương pháp thuỷ canh không hồi lưu để thiết lập hệ thống này. Các
hạt cà chua được làm ẩm và ủ vô trùng trên đóa petri giữ ở nhiệt độ phòng. Khi hạt
nảy mầm khoảng 2 – 5 mm đem hạt chuyển vào những khối mút có kích thước
2×2×2 cm, có khoét lỗ ở giữa để bỏ hạt cà chua vào. Sau đó đem các khối mút đó
bỏ vào trong các lỗ trên tấm xốp. Các dung dòch được chuẩn bò sẵn cho vào trong
- 20 - các khay (mỗi khay một môi trường khác nhau), rồi ráp hai tấm xốp vào trong mỗi
khay. Dung dòch trong khay phải ngập nửa tấm xốp. Các khay được đểû trong nhà
lưới ở nhiệt độ thường.

- PDA ( potato, sucrose, agar).
- TZC (peptone, Glucose, Casein hydrolysate, TZC, Agar).
- LB ( Trytone, Yeast extract, sodium chloride).
Cấu trúc cặp primer PI–IS- F / PI-IS-R, sử dụng trong nghiên cứu này.
Bảng 3.7 Trình tự primers PI-IS-F và PI-IS-R
Primer
Trình tự (5
/
- 3
/
)
Kích thước đoạn
DNA khuếch đại
Nguồn gốc
PI–IS- F
PI-IS-R
CGCAACGCTGGATGAACCC
CAGACGATGCGAAGCCTGAC
1,070 bp
1,070 bp
Yung-An Lee
(Đài Loan) Một sồ hoá chất, emzyme và dung dòch, sử dụng trong ly trích, phản ứng PCR và
điện di.
+ TE 1X (pH =8)

TTC tiếp tục ủ ở nhiệt độ 27
0
C. Sau 4 – 5 ngày tiến hành chọn những khuẩn lạc
mọc sớm (Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường LB lắc lỏng (150 vòng/phút) ở nhiệt
độ 27
0
C khoảng 16 giờ. Lấy 850 ul dòch này cho vào eppendorf và 150 ul glycerol,
trộn đều, cất giữ mẫu ở -80
0
C.
3.4.2.3 Phương pháp xác đònh Ralstonia solanacearum bằng môi trường chọn lọc
TZC
Môi trường TZC sau khi hoà tan bằng nước cất điều chỉnh pH khoảng 7,1 - 7, sau
đó đem vô trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
Các dòng vi khuẩn R. solanacearum sau hai ngày nuôi cấy trên môi trường LB
lỏng (2 ml), thu vi khuẩn bằng cách li tâm 3000 vòng/phút. Rửa 2 lần bằng nước cất
vô trùng. Hòa tan vi khuẩn vào 4 ml nước cất vô trùng lấy 10 ul cho vào đóa petri
có môi trường TZC . Theo dõi trong vòng 3 – 5 ngày và ghi nhận kết quả.

- 23 - 3.4.2.4 Phương pháp ly trích DNA tổng số
Theo phương pháp của Sambrook (1989), có cải tiến.
Bước 1: Nhân vi khuẩn trong môi trường LB lỏng khoảng 16 giờ
Bước 2: Thu vi khuẩn bằng cách ly tâm. Điều kiện 6000 vòng, 5 phút, 4
0
C, bỏ

C.
Bước 12: Thu phần dòch bên trên và chiết xuất với chloroform/isoamyl alcohol
(24:1). Hoà lẫn kỹ, ly tâm 10 phút ở 12000 vòng /phút,4
0
C.
- 24 - Bước 13: Thu phần dung dòch DNA bên trên. Thêm dung dòch sodium
acetate3M, pH = 5,0 và isopropanol. 30 phút ở nhiệt độ -20
0
C, rửa kết tủa với
ethanol 70%, thu kết tủa, làm khô.
Bước 14: Hoà tan kết tủa trong 30 ul dung dòch TE.
3.4.2.5 Phương pháp PCR
Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện theo quy trình của Holloway (1997),
Có cải tiến. Thể tích phản ứng là 25 ul.
Thành phần của phản ứng PCR dùng để xác đònh R. solanacearum.
Bảng 3.8 Thành phần các chất trong phản ứng PCR
Thành phần
Lượng /phản ứng(ul)
Nồng độ cuối
Nước cất
10 mM dNTP
/
s
10 X PCR buffer
MgCl
2
Primer PS-IS-F

C 2 giây, 50
0
C 10 giây, 72
0
C 70 giây, 35 chu kỳ
- Bước 3: 72
0
C 2 phút ; 1chu kỳ
- Bước 4: 4
0
C
Kỷ thuật đòên di
- Chuẩn bò gel 1% (0,25 g agarose trong 25 ml dung dòch TAE 0,5 X )
- Sử dụng 5 ul sản phẩm PCR để kiểm tra kết quả phản ứng
- Chạy điện di ở 100 V, 250 mA, 30 phút
- Nhuộm gel với ethidium bromide, 10 phút
- 25 - - Sử dụng máy agarose gel (trên phần mền quatity one) (Bio – rad) ghi nhận
và đánh giá kết quả.
3.2.2.6 Đánh giá tính kháng của cây cà chua đối với R.solonacearum.
Các dòng vi khuẩn sau khi xác đònh trên môi trường TZC và phương pháp PCR.
Chúng tôi đã chọn 3 dòng vi khuẩn là RST001, RSCc2 và RSBog1, để làm thí
nghiệm đánh giá tính kháng của cây cà chua trồng trong dung dòch.
Cây cà chua trồng trong hệ thống thủy canh sau 14 ngày được dùng để chủng
bệnh. Một dòng vi khuẩn chủng trong một hệ thống thuỷ canh riêng và 3 lần lập
cho một dòng vi khuẩn. Và một hệ thống thuỷ canh dùng làm đối chúng không
trủng bệnh. Phương pháp chủng bệnh theo Dogo và ctv(1997). Theo phương pháp
này dùng vi khuẩn ở dạng huyền phù cho vào dung dòch dinh dưỡng với mật số

+ Nhỏ 20ul dung dòch vi khuẩn ở một mức pha loãng lên đóa petri, với 3 lần
lập lại cho một mức pha loãng, 3 mức pha loãng / đóa
+ Chờ dòch vi khuẩn khô, cho đóa petri vào tủ đònh ôn ở 27
0
C.

+ Sau 1 ngày đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường TZC, chọn mức pha
loãng thích hợp cho việc đếm khuẩn lạc. Tính mật số vi khuẩn CFU/ml.
- 27 - CHƯƠNG4.