21
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả phân lập mẫu
Chúng tôi đã phân lập được 20 dòng nấm R. solani từ các mẫu thực vật bệnh và
sử dụng 20 dòng nấm này để nghiên cứu.
Bảng 3. Danh sách các dòng nấm Rhizoctonia solani được sử dụng trong
nghiên cứu.
Stt
Tên dòng nấm
Kí chủ
Nơi lấy mẫu
1
CX-8
Cải xanh
Tp. HCM
2
SR-650
Sầu riêng
Bình Dương
3
L-74
Lúa
Trà Vinh
4
XL-76
Xà lách

LB-70
Lục bình
Vĩnh Long
13
L-67-04
Lúa
Đồng Tháp
14
B-61
Bắp
Đồng Nai
15
L-61
Lúa
Đồng Nai
16
L-73
Lúa
Tiền Giang
17
L-74
Lúa
Trà Vinh
18
CP-50-02
Cà phê
Dắc Lắc
19
ĐX-61
Đậu xanh


Để phản ứng PCR dược tối ưu thì sản phẩm DNA li trích cần phải tương đối
sạch các tạp chất. Khi DNA khuôn còn lẫn protein, hiệu quả của phản ứng PCR giảm
tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn (Khuất Hữu Thanh, 2003). Vì vậy, để có
DNA khuôn tinh sạch hơn, chúng tôi đã cải tiến qui trình của Lee và Taylor bằng cách
lặp lại khâu khử bỏ protein và các thành phần không mong muốn khác trong mẫu phân
tích. Cụ thể là sau bước 6 của qui trình Lee và Taylor chúng tôi thêm các bước sau:
Từ bước 1 – 6 giống qui trình Lee và Taylor.
 Bước 7 : cho thêm 400µl hỗn hợp dung dịch
chloroform:isoamyl (24:1).
 Bước 8: li tâm 14000g/15phút.
DNA tổng số

23
 Bước 9: hút lấy 200µl dung dịch nổi chuyển sang
eppendorf mới.
 Các bước còn lại giống qui trình Lee và Taylor.
Với qui trình tách chiết này, DNA tổng số nhận được sau khi điện di trên
agarose 0,8%, kết quả cho thấy :
DNA tổng số theo qui trình này ít kéo thành vệt dài hơn, chứng tỏ DNA tổng số
tương đối sạch hơn, thích hợp cho phản ứng PCR hơn (hình 6). Vì vậy, chúng tôi sử
dụng qui trình Lee và Taylor cải tiến để tách chiết DNA tổng số của các dòng nấm R.
Solani. DNA tổng số thu được từ qui trình tách chiết này sẽ được sử dụng để làm
khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo.
Hình 7. Ảnh diện di DNA tồng số sau khi pha loãng chuẩn bị cho phản
ứng PCR

4.3. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. Solani với hai
primer ITS4 và ITS5
Sử dụng 2 primer ITS4 và ITS5 do White và ctv (1991) thiết kế cho vùng ITS
của rDNA (gồm ITS1-5,8S-ITS2), sản phẩm sản phẩm khuếch đại được dự kiến có
kích thước khoảng 700bp.
Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR được thực hiện với 10 – 100ng DNA, 1X
DNA polymerase buffer, 1,5 mM MgCl
2
, 1µM cho mỗi primer ITS4 và ITS5, 1U Taq
DNA polymerase (hình 8). DNA tổng số pha
loãng
Sản phẩm PCR

Băng phụ
700bp
26
Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm PCR có nồng độ primer là 0,4µM
(0,4pmol/µl).

Sản phẩm PCR có nồng độ primer 0,4µM (0,4pmol/µl) không còn thấy sản
phẩm phụ nữa. Như vậy, với thành phần phản ứng PCR là 10 – 100ng DNA, 1X DNA
polymerase buffer, 1,5 mM MgCl
2
, 0,4µM cho mỗi primer ITS4 và ITS5, 1U Taq
DNA polymerase, vùng rDNA-ITS đã được khuếch đại thành công. Sản phẩm có kích
thước khoảng 700bp.

thể phát sáng nhất định nên làm nhiễu sóng trong quá trình phân tích trình tự. Như
vậy, kit tinh sạch của Bio-rad mà chúng tôi đã sử dụng để tinh sạch DNA có thể là
không phù hợp cho quá trình đọc trình tự. Vì vậy, chúng tôi thử sử dụng một kit
khác để làm tinh sạch mẫu.
Chúng tôi sử dụng kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purication” của công
ty Amersham để tinh sạch. Qui trình tinh sạch gồm các bước chính sau:
 Cắt band DNA từ gel sau khi điện di, băm gel thành từng lát nhỏ.
 Cho gel vào eppendorf.
 Thêm 10μl capture buffer vào cho mỗi 10mg gel.
 Ủ trong nhiệt độ 60
0
C trong 15 phút cho đến khi gel tan hết.
 Sau khi gel tan hết thì li tâm lạnh thu mẫu.
 Chuyển mẫu đã thu được vào cột GFX , ủ nhiệt độ phòng trong 1
phút.
 Li tâm 10000 vòng 30giây.
 Bỏ nước dưới eppendorf, đặt cột GFX vào eppendorf khác.
 Thêm 500μl wash buffer và li tâm 30 giây.
 Chuyển cột GFX vào tip khác.
 Thêm 50 μl elution buffer, nhỏ từ từ trên cột.
 Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng 1 phút.
 Li tâm 10000 vòng 1 phút thu mẫu DNA đã được tinh sạch.

28

Hình 10. Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03


gtcaaatcga ctattagaag cggttcgtct tgcatttacc ttggccacct ttttacagtg
tcctcagcga tagataactt atcacgccga gtggaaccaa gcataacact tagagatcca
gctaataaac atatacgcgc agggtgtgaa actgcaaagt actccaaaac caaagtaaga
gaccagttga attaacatta ggtttacttt gagacacccc ctgaactcaa aaggtatgtt
ccaggaaagg ag
Do 2 chuỗi DNA đã đọc được là quá ngắn nên chúng tôi không xác định
được trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03.
4.4.2. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650
Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 đã đọc được là
602bp. Trình tự như sau:

ggggaattat tgtatttatt accgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat
gtgcacattc ttctctttca tccacacacc cctgtgcacc tgtgagacag tcacaaggtc
attttggagt ttgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc
ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat
gtaacgcatc taatactaag tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa
cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcggaattca gtgaatcatc gaatctttga
acgcaccttg cgctccttgg tattccttgg agcatgcctg tttgagtatc ctgaaatctt
caaagtaaac cttttgttaa ttcaatcggt ctcttacttt ggttttggag gtctttgcag
tttcacaccc tgctcctctt tgtttattag ctggatctct aagtgttatg cttggttcca