1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Rhizoctonia solani Kuhn là một loài nấm phổ biến trong đất, có địa bàn phân bố
rộng khắp thế giới. Nấm gây hại trên các giai đoạn phát triển của cây từ tiền nảy mầm
đến trổ bông, tạo tán và ở tất cả các bộ phận của cây từ rễ đến trái. Nấm này là nguyên
nhân gây bệnh đốm vằn trên lúa. Ngoài ra, nấm này còn là nguyên nhân gây thối hạt
giống làm thối thân, thối rễ, thối trái và gây bệnh cháy lá ở rất nhiều cây trồng thuộc
các họ thực vật khác nhau.
Ở nước ta, điều kiện khí hậu và tập quán canh tác rất thích hợp cho nấm
Rhizoctonia solani tồn lưu, phát triển và gây bệnh. Bệnh đốm vằn hại lúa do nấm này
gây ra được đánh giá là một bệnh nguy hiểm, làm giảm năng suất lúa một cách nghiêm
trọng ở các tỉnh phía Nam. Nấm này cũng được xem là một tác nhân quan trọng gây ra
bệnh chết cây con cho bông vải thuốc là và nhiều loại rau đậu.
Hiểu biết về lịch sử đời sống của nấm gây bệnh cây là quan trọng trong việc phát
triển các chiến lược thích hợp để quản lí bệnh do chúng gây ra. Nghiên cứu trên thế
giới đã công bố về sự đa dạng di truyền và mối quan hệ trong và giữa các quần thể
nấm R. solani từ nhiều cây trồng và nhiều vùng địa lí khác nhau. Tuy nhiên các nghiên
cứu về vấn đề này ở nước ta còn rất ít.
Khả năng sử dụng các kỹ thuật phân tử để phân tích sự đa dạng di truyền giữa các
dòng phân lập của nấm R. solani đã được chứng minh (Kuninaga và ctv, 1997;
Matsumoto và ctv, 1996; Liu và Sinclair, 1992; O’Brien, 1994; Boysen và ctv, 1996).
Các kỹ thuật như lai DNA/DNA, RFLP, RAPD, Southern blot đã phân chia các dòng
phân lập R. solani thành các nhóm riêng biệt về mặt di truyền. Trong đó có kỹ thuật
đọc trình tự DNA dường như cung cấp số liệu tốt nhất cho việc nhận biết về sự biến
động di truyền trong và giữa các quần thể R. solani.

3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani
2.1.1. Vị trí phân loại
Nấm Rhizoctonia solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia Sterilia, lớp nấm bất toàn
Fungi Imperfecti, giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là Thanatephorus cucumeris,
thuộc lớp nấm Basidomycetes. Đây là nhóm nấm lớn, phân bố rộng, kí sinh không
chuyên tính có phổ kí chủ rộng (Carling và ctv, 1992). Hiện nay, chưa thấy công bố
giai đoạn hữu tính của nấm này ở Việt Nam. Nấm gây bệnh chủ yếu dưới dạng vô tính
là Rhizoctonia solani.
2.1.2. Đặc điểm hình thái của nấm Rhizoctonia solani
Nấm R. solani có dạng sợi dài, tạo hạch và không sinh bào tử. Sợi nấm trong
mô tế bào khi còn non không có màu, khi trưởng thành có màu nâu vàng nhạt. Sợi nấm
đa bào, phân nhánh tương đối thẳng góc với sợi nấm chính. Chỗ phân nhánh hơi thắt
nhỏ lại. Sợi nấm trưởng thành có đường kính từ 8 – 12µm (Nguyễn Việt Long, 2001).
Nấm tạo hạch trên cây kí chủ, hạch không đều, có hình tròn dẹt ở phía dưới, khi

giảm tiềm năng lây bệnh từ hạch nấm nằm trong nước (Nguyễn Việt Long, 2001).
Nấm R. solani lây lan chủ yếu bằng hạch nấm qua cỏ dại, qua rơm rạ và hạch rơi
rụng từ vụ trước. Các hạch nấm này gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành sợi nấm
và gây bệnh trở lại. Ngoài ra, nấm có thể lưu tồn trong thân, xác bã thực vật và cả
trong đất. Nấm cũng có thể lan truyền bệnh bằng các sợi nấm còn tồn tại trong gốc rạ
hoặc các lá bị bệnh sau khi thu hoạch. Sự lan truyền của hạch nấm cũng có thể do các
dòng nước cuốn đi, do mưa hoặc các dòng nước trên đồng ruộng. Các hạch nấm này
gặp các cây kí chủ thích hợp sẽ bám vào và phát triển (Papavizas và ctv, 1957).
Trong phòng thí nghiệm, nấm R. solanni có thể mọc tốt trên nhiều loại môi
trường khác nhau như PDA, PGA, PGB, không đòi hỏi môi trường chuyên biệt.
Nhưng nấm này phát triển tốt nhất trên môi trường PGA. Nấm phát triển rất nhanh,
khoảng 3 – 4 ngày là đầy đĩa petri và hạch nấm bắt đầu hình thành. Sợi nấm lúc đầu
màu trắng trong nhưng khoảng 2 – 3 ngày sau sợi nấm chuyển thành màu nâu. Ban
đầu, hạch nấm nhỏ li ti và có màu trắng. Hạch thường mọc rải rác khắp đĩa, nhưng một
số dòng nấm thì hạch mọc rời và cũng có dòng, hạch mọc thành từng mảng liên kết
nhau. Sau 2 – 3 ngày, hạch nấm lớn dần và chuyển thành màu nâu đậm. Trên môi
trường nuôi cấy, hạch nấm có kích thước lớn hơn hạch nấm trong điều kiện tự nhiên.
Nấm R. solani có thể lưu giữ được ở nhiệt độ phòng từ 6 – 12 tháng trong ống nghiệm
chứa môi trường PGA.
2.1.4. Phổ kí chủ của nấm Rhizoctonia solani
Nấm R. solani là nấm đa thực bán kí sinh điển hình, có phổ kí chủ rộng. Nấm
này có thể xâm nhiễm và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Có khoảng 200
loài thực vật bao gồm cây lương thực, cây hoa màu, cây công nghiệp và các loại cỏ
khác nhau bị nấm này gây hại. Nấm R. solani xuất hiện khắp nơi trên thế giới và gây
thiệt hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau.
Nấm R. solani có khả năng gây bệnh trên rất nhiều loại cây khác nhau, gây bệnh
bao gồm rất nhiều loại cây như: lúa, ngô (bắp), các cây họ đậu, lục bình, rau

Phân tử DNA được làm biến tính (denaturation) ở nhiệt độ cao là khoảng 94
0
C – 96
0
C trong thời gian là 30 giây đến 1 phút. Ở giai đoạn này các phân tử DNA mạch kép tách
thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch
bổ sung mới.
6

2.2.2.2. Giai đoạn lai (annealing)
Nhiệt độ đựơc hạ thấp cho phép các mồi (primer) bắt cặp với khuôn, trong thực
nghiệm nhiệt độ này phụ thuộc vào nhiệt nóng chảy của mồi (primer). Thời gian của
giai đoạn này là 30 giây đến 1 phút.
2.2.2.3. Kéo dài (extension)
Nhiệt độ được tăng đến 72
0
C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt. Thời
gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường từ 30 giây đến
vài phút tùy thuộc vào kích thước của trình tự DNA cần khuếch đại. Sau vài chục chu
kì thì số lượng DNA khuếch đại tăng theo hàm số mũ như sau:
M = m.2
n

Trong đó:
M: số lượng DNA cần tổng hợp.
m: là số lượng DNA ban đầu
n: là số chu kì phản ứng.

Thermus aquaticus (Taq). Taq polymerase có những đặc điểm như: hồi phục sau khi
chịu tác động của nhiệt, enzyme này hoạt động tốt ở nhiệt độ cao và có tính ổn định
nhiệt cao. Nhiệt độ tối hảo đối với enzyme Taq trong phản ứng sinh tổng hợp DNA là
khoảng 70 – 72
0
C. Enzyme này cho phép chúng ta tổng hợp dây DNA mới có tính lấp
đi lấp lại nhiều lần.
Nồng độ của enzyme DNA polymerase cũng đóng một vai trò quyết định trong
phản ứng PCR. Thông thường, nồng độ enzyme được khuyến cáo sử dụng là từ 1 –
2,5U cho một phản ứng từ 25µl – 50µl. Nếu như nồng độ Taq quá cao những sản
phẩm không chuyên tính sẽ xuất hiện và làm sai lệch kết quả. Nếu như lượng Taq quá
thấp thì sẽ không đủ số lượng để xúc tác tạo ra sản phẩm theo mong muốn.
2.2.3.3. Mồi (primer)
Trong PCR chuẩn cần có một cặp primer. Sự khuếch đại chuyên biệt nào đối
với một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tùy thuộc vào primer tương ứng. Có hai
loại primer trong phản ứng PCR chuẩn, đó là primer xuôi (forward primer) và primer
ngược (reserve primer). Primer xuôi bắt cặp và gắn vào đầu 3’ của mạch khuôn 5’ –
3’, primer ngược bắt cặp và bổ sung gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’ – 5’. Đối với
primer hai yếu tố chính ảnh hưởng tới nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn
là chiều dài của primer và thành phần G, C trong cấu tạo của primer. Nhiệt độ tác động
ở đầu dây đơn được tính như sau: T
m
= 2x(A+T)+4x(G+C). Trong cấu trúc primer
thông thường thì có khoảng 15 – 30 nucleotide. Primer có nhiều G và C thì số lượng
nucleotide ít đi còn khoảng 18 – 20 nucleotide (Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang,
1999). Khi chọn primer thì nhiệt độ nóng chảy (Tm) của hai primer chênh lệch nhau
không quá lớn. Trình tự DNA cần khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai primer không

cao sẽ làm cho
dây đôi DNA ổn định hơn, làm sự biến tính và tách DNA từ sợi đôi thành sợi đơn
giảm, kết quả là sản phẩm PCR ít đi. Lượng dư Mg
2+
sẽ làm cho hiện tượng annealing
không chuyên tính xảy ra, quá trình bắt cặp ở những vị trí không đúng sẽ xảy ra và cho
ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng lớn, nhưng độ chuyên tính thấp.
Ngược lại, nếu nồng độ Mg
2+
quá thấp, nó sẽ làm xấu đi quá trình extension (kéo dài
chuỗi mã đối lập với dây gốc). Do đó, người ta cần phải xác định nồng độ tối ưu của
ion Mg
2+
nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của sản phẩm
PCR.
2.2.4. Ứng dụng của kĩ thuật PCR
PCR có ứng dụng cực kì rộng trong công nghệ sinh học hiện đại. Theo nguyên
tắc trên , đã có nhiều bổ sung để đưa PCR phục vụ nhiều mục tiêu khác nhau, trong
nhiều lĩnh vực khác nhau.
 Ứng dụng trong di truyền
PCR dùng để nhân bản vô tính DNA với số lượng lớn.
PCR là công cụ đắc lực cho việc lập bản đồ gen của sinh vật. Phương pháp này
được gọi là phân tích DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên (Random amplified
polymorphism DNA, RAPD). Trong phương pháp RAPD, PCR được thực hiện với
9
các primer ngẫu nhiên (random primer). Kết quả là tạo ra một số đoạn DNA có chiều
dài khác nhau, đặc trưng cho mỗi loài, thậm chí mỗi cá thể. So sánh điện di sản phẩm


10
thúc theo chuỗi, xác định base nào đó từng điểm cuối cùng trong chuỗi mã, cứ như vậy
làm cho 3 base còn lại.
Phương pháp thực hiện gồm 3 bước chính
Bước 1: chuỗi DNA cần đọc trình tự được đánh dấu phóng xạ ở đầu 5’-P bằng
P
32
.
Một dây đơn oligonucleotide có đánh dấu phóng xạ được chia thành 4 phản
ứng. Trong mỗi 4 phản ứng, oligonucleotide có một đầu cố định và một đầu có phân tử
A, T, G và C. Sản phảm của mỗi phản ứng được điện di trên gel polyacrylamide có độ
phân giải cao. Chụp gel ảnh của DNA theo phương pháp phóng xạ tự ghi.
Các mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ được xử lí theo 4 nhóm phản ứng như
sau:
Nhóm thứ nhất xử lí các mạch đơn DNA bằng dimethylsulphate ở
pH=8 làm đứt mạch đơn tại G.
Nhóm thứ hai xử lí mạch đơn DNA bằng acid có pH=2 gây đứt mạch
đơn tại A và G.
Nhóm phản ứng thứ ba xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin gây đứt
mạch đơn tại C và T.
Nhóm phản ứng thứ tư xử lí mạch đơn DNA bằng hidrazin với nồng
độ muối NaCl 1,5M làm cho mạch đơn bị đứt tại C.

11
Hình 1: Lược đồ đọc trình tự của phương pháp Maxam và Gilbert



C T A G
ddNTP Reaction Mix

3’
G
C
A
T
T
C
C
A
T
A
G
G
5’
chuỗi đánh dấu (P32)
C
C 12
gp cỏc nucleotide khụng cú nhúm OH (dideoxynucleotide) thỡ phn ng tng
hp b dng li.
c trng ca phng phỏp ny l s dng dideoxynucleotide lm

ng phn
ng A

ng phn
ng Cng phn
ng GdATP
dCTP
dTTP
dGTP
ddCTP

dATP
dCTP
dTTP
dGTP
ddGTP

dATP
dCTP
dTTP
dGTP
ddTTP

on DNA cn gii trỡnh t


Primer sequencing
*
*
*
*
*
13

Hình 3: Lược đồ công thức của dNTP và ddNTP
A: dNTP
B: ddNTP

2.4. Vùng ITS (internal transcribed spacer) của rDNA (ribosomal
deoxynucleotide acide)

Khi một ddNTP mới được thêm
vào để kéo dài chuỗi DNA thì
sẽ không thêm vào được vì
không có nhóm –OH.
OH
(P)-(P)-(P)-

(A)
(B)
14
cho việc thiết kế các primer cho phản ứng PCR, RAPD, đọc trình tự. Nhưng cũng có
những vùng biến động rất lớn, đặc điểm này thích hợp cho việc đánh giá sự đa dạng di
truyền của các dòng nấm khác nhau bằng kỹ thuật RFLP.
Ở nấm R. solani sự đa dạng di truyền có liên quan nhiều tới trình tự của các
đoạn ITS. Khi các dòng nấm gần giống nhau về mặt di truyền thì chúng càng giống
nhau về trình tự của các đoạn ITS.
2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về sự đa dang di truyền của nấm
Rhizoctoniac solani
2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc
Nguyễn Thị Nghiêm (1997), bằng phương pháp đánh dấu phân tử với kỹ
thuật PCR với 2 primer riệng biệt ERIC1 và ERIC2 đã phân chia 137 dòng nấm
Rhizoctonia solani Kuhn thu thập ở Đồng Bằng Sông Cửu Long thành 33 nhóm
nấm mang tính đa dạng di truyền khác nhau.
2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc
Kuninaga và ctv (1997), đã phân tích trình tự của rDNA chứa những
vùng ITS và 5,8S rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền giữa 45 dòng nấm
R. Solani đại diện cho các nhóm liên hợp khác nhau. Kết quả của họ cho thấy


16
PHẦN III
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Địa điểm và thời gian nghiên cứu
 Địa điểm:
 Phòng thực tập bệnh cây bộ môn bảo vệ thực vật, khoa
Nông Học Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí