19
- Giấy thấm vô trùng
- Buồng lắc định ôn.
Phục hồi và nhân sinh khối nấm R. solani
Các dòng nấm được giữ trong môi trường ống nghiệm lâu ngày có thể bị
nhiễm hoặc mọc yếu. Cho nên trước khi sử dụng, chúng tôi cấy chuyền nấm ra môi
trường thạch đĩa để phục hồi và loại bỏ nhiễm.
- Phục hồi: môi trường PGA (Potato-glucose-agar). Thành phần để nấu
một lít môi trường PGA.
+ Khoai tây: 200 g
+ Glucose: 20 g
+ Agar: 18-20 g
+ Nước cất: 1lít
Môi trường được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 121
o
C, 20 phút. Sau đó
được đổ vào đĩa peitri sạch, khoảng từ 15 – 20 ml mỗi đĩa.
Nấm từ các ống giống được cấy trên môi trường thạch đĩa và ủ ở nhiệt độ
25
o
C trong vòng 1 – 2 ngày.
- Nhân sinh khối: môi trường PGB (potato-glucose broth).
+ Môi trường PGB sau khi nấu được lọc qua giấy thấm hoặc bông gòn.
+ Cho vào mỗi bình tam giác 50 ml môi trường và hấp khử trùng bằng
Autoclave ở 121
o
C trong 20 phút.
+ Nấm đã phục hồi trên môi trường PGA được cho vào các bình tam giác
chứa môi trường lỏng và nuôi lắc 4 ngày ở điều kiện từ 27 – 28
o

- Giấy thấm
- Tủ 4
o
C và - 20
o
C
Quy trình ly trích DNA tổng số
- Nghiền 0,1 – 0,3 g sợi nấm đã được làm khô kiệt trong nitơ lỏng.
- Thêm 600 µl lysis buffer và vortex cho tới khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu
hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer (cho tới 700 µl).
- Ủ 1h ở 65
o
C.
- Thêm một thể tích tương ứng (600 µl) hỗn hợp phenol, chloroform và
isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1), và lắc nhẹ.
- Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
- Chuyển dịch nổi (khoảng 400 µl) vào một ống eppendorf mới.
- Thêm 400 µl hỗn hợp chloroform, izoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ. Ly
tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (25 – 28
o
C).
- Hút lấy dịch nổi (khoảng 200 µl) vào một epffendorf mới.
- Kết tủa DNA bằng cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) và 0,5
thể tích isopropanol (100 µl). Trộn nhẹ nhàng nhưng cẩn thận.
- Ly tâm 5 phút (14000 vòng/phút ở 4
o
C)

21
- Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa 3 lần với ethanol 70% lạnh.

ITS4: 5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’
ITS5: 5’ GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 3’
Bảng 3.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bƣớc của phản ứng
Nhiệt độ
Thời gian
Giai đoạn khởi động
Chạy chu kỳ (30 chu kỳ)
Tách DNA khuôn
Ủ bắt cặp
Kéo dài
94
o
C

94
o
C
56
o
C
72
o
C
3 phút

1 phút
30 giây
1 phút


- Agarose
- TAE 0,5X
- Loading dye 6X
- Ethidium bromide
Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng để điện di và đọc kết quả
- Cân kĩ thuật 4 số
- Lò viba
- Khay đổ gel
- Bồn và máy điện di (Bio-rad)
- Giấy parafin
- Máy chụp hình gel (Gel doc).
- Ống đong
Quy trình thực hiện
- Cho 0,1875 g agarose vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X (nồng độ 1,5%).
- Đun sôi hỗn hợp trên khoảng hai phút trong lò viba.
- Để nguội ở nhiệt độ phòng còn khoảng 50
o
C.
- Đổ gel vào khay (đặt lược tạo giếng trước khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí
khi đổ gel.

23
- Để gel đông đặc lại ở nhiệt độ phòng, rút lược ra khỏi gel, cho gel vào
bồn điện di chứa dung dịch TAE 0,5X.
- Trộn 2-3 µl sản phẩm PCR với 1µl loading dye và cho vào giếng của gel.
- Vận hành máy điện di ở 50V trong khoảng 50 – 60 phút.
Đọc kết quả điện di
Sau khi điện di, gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide từ 5 -
15 phút. Vớt ra, rửa lại nhiều lần với nước và đọc kết quả dưới tia UV. DNA liên kết
với ethidium bromide sẽ phát sáng dưới tia UV. Chụp ảnh kết quả điện di bằng máy

Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani
Tách chiết DNA là bước quan trọng đầu tiên để cho phép phản ứng PCR có thành
công hay không. Việc tách chiết phải đảm bảo thu nhận được lượng DNA có trong
mẫu. Mặt khác, DNA thu được cũng phải có độ tinh sạch nhất định.
Theo quy trình ly trích như phương pháp đã nêu ở mục 3.3.2, chúng tôi đã ly
trích được DNA tổng số của các dòng nấm Rhizoctonia solani. DNA đã được kiểm tra
bằng phương pháp điện di trên gel agarose (Hình 4.1). Do không xử lý RNAse nên vẫn
còn lẫn RNA nhưng DNA thu được tương đối sạch để thực hiện phản ứng PCR.
Hình 4.1. Ảnh điện di DNA tổng số của một số dòng nấm R. solani
chƣa xử lý RNase.
1. ĐHL-63; 2. BV-61-01; 3. CP-50-02; 4. BN-61-01
5. ĐT-77; 6. BV-50-01; 7. BV-61-05; 8. BĐ-TL
9. CLV-72-02; 10. CX-8-02; 11. TL-72; 12. CTĐ-77

Nguyễn Thị Huệ (2003), áp dụng quy trình ly trích DNA của Raeder và Broda
(1985), đã thu được DNA tổng số của nấm R. solani. Nhưng quy trình cần 1 giờ để ly
tâm loại bỏ cặn nấm và sử dụng RNase để xử lý RNA. Như vậy quy trình ly trích
chúng tôi đã thực hiện là đơn giản, ít tốn kém, và tiết kiệm thời gian hơn so với

4.2.2. Khảo sát chu trình nhiệt
Chúng tôi tiến hành khảo sát 4 chu trình nhiệt để tìm ra chu trình nhiệt thích hợp
cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn rDNA-ITS của nấm R. solani với hai primer
ITS 4 và ITS 5 (White và ctv. 1990).

Bảng 4.1. Các chu trình nhiệt đƣợc khảo sát
Chu trình 1
Chu trình 2
Chu trình 3
Chu trình 4
94
o
C: 3 phút
94
o
C: 30 giây
56
o
C: 1 phút
72
o
C: 1 phút
72
o
C: 7 phút
94
o
C: 3 phút
94
o

C: 1 phút
56
o
C: 30 giây
72
o
C: 1 phút
72
o
C: 7 phút

Chúng tôi đã nhận được kết quả thể hiện qua Hình 4.3.
Hình 4.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các chu trình nhiệt khác nhau
(A). Chu trình 1; (B). Chu trình 2; (C). Chu trình 3; (D). Chu trình 4

Kết quả điện di trên agarose cho thấy, cả 4 chu trình, chúng tôi đều khuếch đại
được vùng rDNA-ITS của nấm R. solani. Sản phẩm có kích thước khoảng 700 bp.
Tuy nhiên, ở chu trình 1, phần dư rất rõ bên dưới và có một băng mờ bên trên băng
chính. Ở chu trình 4, mặc dù phần dư không thể hiện nhưng băng sản phẩm mờ hơn
băng sản phẩm của chu trình 2 và chu trình 3. Mặt khác, tỉ lệ thành công của phản ứng
khi áp dụng chu trình 4 thấp (tỉ lệ là 2 lần thành công trên 5 lần thực hiện). Giữa chu
(A) (B) (C)
Hình 4.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các nồng độ primer khác nhau
(A). 2 pmol/µl; (B). 1 pmol/µl; (C). 0,4 pmol/µl

Kết quả cho thấy, với primer có nồng độ 2 pmol/µl, phần dư vẫn còn thể hiện rõ.
Với primer có nồng độ 1 pmol/µl, và 0,4 pmol/µl, phần dư giảm hẳn xuống. Giữa hai
nồng độ primer 1 pmol/µl, và 0,4 pmol/µl, chúng tôi lựa chọn nồng độ 0,4 pmol/µl để
tiết kiệm primer.
Như vậy, chúng tôi đã chọn được quy trình PCR để khuếch đại đoạn rDNA – ITS
của nấm R. solani cho kết quả tốt nhất. Quy trình này được thể hiện qua Bảng 4.2 và
Bảng 4.3. 700bp