BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis)
Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
BẰNG KỸ THUẬT RAPD
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: NGÔ TRẦN VŨ Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
iii
LỜI CẢM TẠ
Con xin thành kính ghi ơn Ba, Mẹ cùng ngƣời thân trong gia đình luôn quan
tâm, tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt
thời gian học tập và thực tập.
- Các Thầy, Cô giáo trong bộ môn CNSH và các Thầy, Cô đã trực tiếp giảng dạy
trong suốt quá trình học tập 4 năm qua.
- Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
- Các anh chị trong Trung tâm Phân tích Hoá sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm đã
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
- Các anh chị ở Ban quản lý rừng Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian
làm đề tài.
- Toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm
học.
Tp. Hồ Chí Minh Tháng 9 năm 2007
Sinh viên thực hiện
Ngô Trần Vũ
- Primer 1 cho một band kích thƣớc 400bp nên không có ý nghĩa trong nghiên
cứu đa dạng di truyền.
- Bƣớc đầu khảo nghiệm primer OPAC10, xác định điều kiện tối ƣu cho primer.
- Nghiên cứu đa dạng di truyền cây mắm trên primer OPAC10 của 11 mẫu thu
đƣợc trung bình 5,4 band/mẫu. Tỷ lệ đồng hình 62,5% và tỷ lệ đa hình 37,5%
trong đó 5 band đồng hình và 3 band đa hình. Phân tích trên phân mềm
NTSYSpc 2.1, cây phân nhóm di truyền cho đồng hình khá cao. Cây phân
nhóm di truyền chia làm 2 nhóm, nhóm I có hệ số đồng dạng di truyền cao
0,875-1. Nhóm 2 thu đƣợc một nhánh do không đủ điều kiện thực hiện trên
nhiều mẫu.
v
SUMMARY
Ngo Tran Vu, Nong Lam University, 9/2007. “RESEARCH ON METHOD
DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avecinnia
officinalis IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE AREA BY RAPD-
PCR”.
Supervisor:
Bui Minh Tri
Can Gio mangrove forest was economic and environmental value, it was very
important for air-condition and waste water treatment of Ho Chi Minh City. Can Gio
mangrove forest had rich and diversified floristic composition. So, studying genetic
diversity of Avecinnia officinalis tree aimed conserve genetic resource gene.
The obtained results were:
- To collect 50 samples leaf with many tree different characteristic.
2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn ............................................. 3
2.1.1. Giới thiệu khu vực dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn ............................................ 3
2.1.2. Vai Trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .................................. 4
2.2. Một số khái niệm về đa dạng sinh học .................................................................... 5
2.2.1. Đa dạng sinh học ..................................................................................................... 5
2.2.2 Sự đa dạng di truyền ................................................................................................ 5
2.2.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bảo vệ sự đa dạng di truyền ................................. 6
2.3. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây mắm đen ..................................... 6
2.3.1. Hình thái học ........................................................................................................... 6
2.3.2. Phân bố ................................................................................................................... 8
2.3.3. Vai trò của rừng mắm ............................................................................................. 9
2.4. Các kỹ thuật trong tách chiết DNA ......................................................................... 9
2.4.1. Các thông tin di truyền ............................................................................................ 9
2.4.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA ............................................................................... 10
vii
2.4.3. Đánh giá chất lƣợng DNA ..................................................................................... 11
2.4.3.1. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế .................................................................. 11
2.4.3.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di .......................................................... 12
2.5. PCR (polymerase chain reaction) .......................................................................... 12
2.5.1. Nguyên tắc ............................................................................................................ 12
2.5.2. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR ................................................................. 14
2.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới PCR .............................................................................. 14
2.5.4. Ƣu điểm và nhƣợc điểm ........................................................................................ 14
2.6. Một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học .................................. 15
2.6.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ............................... 15
2.6.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ..................................... 16
2.6.3. Chỉ thị AFLP ......................................................................................................... 17
4.2. Bảo quản và ly trích vật liệu di truyền ................................................................. 33
4.2.1. Bảo quản ................................................................................................................ 33
4.2.2. Ly trích vật liệu di truyền ...................................................................................... 33
4.3. Kết quả phản ứng RAPD-PCR .............................................................................. 37
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 45
5.1. Kết luận ................................................................................................................. 45
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 45
Chƣơng 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 47
ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Thành phần hóa chất dung dịch ly trích EB .................................................... 19
x
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Hình dáng cây mắm đen ................................................................................... 6
Hình 2.2. Lá và hoa của cây mắm đen .............................................................................. 7
Hình 2.3. Trái của cây mắm đen ....................................................................................... 7
Hình 2.4. Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR ...................................................... 12
Hình 2.5. Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP ....................................................................... 14
Hình 2.6. Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật RAPD ..................................................... 15
Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu mắm đen ở Cần Giờ ..................................................... 32
Hình 4.2. Ly trích DNA theo qui trình Doyle và Doyle (1988) ..................................... 33
Hình 4.3. Ly trích theo qui trình Doyle và Doyle (1988) cải tiến ................................. 34
Hình 4.4. Ly trích DNA theo qui trình nitơ lỏng ........................................................... 36
Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA10 và
OPA5 .............................................................................................................. 37
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer RAH8 ............. 38
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer 1 ...................... 39
Hình 4.8. Kích thƣớc band phản ứng RAPD-PCR của primer 1 .................................... 39
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPAC10 ......... 40
Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 2 .................................................... 41
Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 3 .................................................... 41
Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPAC10 khi đã tối ƣu ........ 42
Hình 4.13. Cây phân nhóm di truyền của 11 mẫu mắm đen ............................................ 43
WWF: World Wildlife Fund (quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên)
1
Chƣơng 1
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Mắm là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn, phân bố trong các vùng bờ biển
nằm trong khoảng giữa triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến. [13]
Trƣớc đây, ở Việt Nam cây mắm dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi.
Ngày nay, cây mắm cũng cung cấp nguyên liệu cho việc chế biến dƣợc và cung cấp
sắc tố cho công nghiệp. [15]
Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ phải chịu hàng ngàn tấn
bom đạn cùng với đó là một lƣợng hóa chất khổng lồ đã đổ xuống đây làm cho rừng bị
tàn phá khủng khiếp. Do vậy, từ năm 1978 huyện Cần Giờ đã tiến hành khôi phục lại
hệ sinh thái rừng ngập mặn, sau 22 năm khôi phục tổ chức UNESCO đã công nhận là
“khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày 21/02/2000.[10]
Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi
trƣờng, là khu làm sạch môi trƣờng sinh thái, môi trƣờng nƣớc và không khí Thành
phố đã bị ô nhiễm nghiêm trọng. Rừng ngập mặn Cần Giờ vừa là rừng phòng hộ, vừa
là rừng bảo vệ Thành phố Hồ Chí Minh [2]. Vì thế việc nghiên cứu đa dạng di truyền
của cây mắm là vô cùng cấp thiết nhằm có chiến lƣợc quản lý và phát triển khu dự trữ
Chƣa đủ điều kiện tiến hành kiểm tra tất cả các primer và các tổ hợp các primer.
Thời gian thực hiện ngắn từ 05/05/2007 đến 01/09/2007.
3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn
2.1.1. Giới thiệu khu vực dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn
Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ nằm ở vùng ven biển vịnh Gềnh Rái và cửa
sông Đồng Nai với hệ sinh thái rừng ngập mặn đặc trƣng, có diện tích gần 71,370 ha.
Rừng ngập mặn đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt
đới không chỉ cung cấp lâm sản có giá trị mà còn là nơi cƣ trú của nhiều loài hải sản,
chim nƣớc, chim di cƣ và một số loài động vật lƣỡng cƣ trên cạn. [10]
Rừng ngập mặn Cần Giờ có cấu trúc địa chất khác xa khu vực rừng ngập mặn
Minh Hải, nền thổ nhƣỡng chủ yếu là các loại đất phát triển giàu hữu cơ, bị mặn nặng
và đất phèn tiềm tàng cận duyên nên hệ sinh thái môi trƣờng rừng ngập mặn Cần Giờ
mang nét đặc thù riêng so với các rừng ngập mặn khác của Việt Nam. [2]
Tên gọi và phân bố:
Tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí
Minh.
Tên ngắn gọn: Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ.
cung cấp chất hữu cơ cho đất và đây là nguồn dinh dƣỡng quan trọng cho vi sinh vật
bậc thấp sinh sống, đồng thời là nguồn dinh dƣỡng không thể thiếu cho sinh vật phù du
tham gia vào dây chuyền thức ăn và liên hệ với động thực vật trong rừng ngập mặn.
[2]
Tại rừng ngập mặn Cần Giờ chủ yếu là sự hiện diện của cây đƣớc (Rhziophora
apiculata), cây mắm trắng (Avicennia alba), đƣng (Rhzophora mucronata), vẹt
(Sonneratia alba), xu (Xylocarpus spp), cóc (Lumnizera spp), chà là (Phoenix
paludosa), giá (Excoecaria aagallocha), mắm đen (Avicennia officinalis), v.v… và nó
thể hiện quy luật diễn thế thảm thực vật rừng ngập mặn, theo độ cao địa một hình rõ
rệt và nhạy cảm. [14]
2.1.2. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Điều tiết khí hậu, giảm thiểu ô nhiễm không khí. Rừng ngập mặn Cần Giờ với
độ che phủ cao chính là “lá phổi xanh” của Thành phố. Đây là vùng xử lý khí độc, góp
phần làm bầu không khí trong lành, điều tiết nhiệt độ, độ ẩm, ngăn cản gió bão. Với
một Thành phố trên 5 triệu ngƣời cùng với hàng chục đô thị, khu công nghiệp ở Bà
Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, hàng ngàn cơ sở sản xuất, hàng triệu xe có động cơ mà
không có rừng này chắc chắn sức khỏe của ngƣời dân sẽ bị ảnh hƣởng xấu. [13]
Xử lý nƣớc thải và các tác nhân ô nhiễm từ đất liền. Các bãi bồi vùng rừng ngập
mặn vừa có tác dụng ngăn sóng, cản trở xói mòn bờ biển, vừa có giá trị to lớn trong
việc phân hủy theo cơ chế sinh hóa các tác nhân ô nhiễm từ Thành phố, các khu công
nghiệp do sông thải ra. Nếu bê tông hóa các bãi bồi này phần lớn chất ô nhiễm sẽ đƣợc
chuyển ra vịnh Gành Rái gây ô nhiễm biển, gây suy giảm nghề thủy sản và du lịch cho
Cần Giờ, Vũng Tàu, Đồng Nai, Long An. Nhiều nghiên cứu cho thấy muốn làm sạch
các kênh Nhiêu Lộc, Thị Nghè, Tân Hóa - Lò Gốm, Tham Lƣơng và xử lý nƣớc thải
sinh hoạt khu vực Thành phố Hồ Chí Minh phải cần đến 300 - 500 triệu USD để xây
5
dựng các công trình. Nhƣ vậy, giá trị kinh tế vùng sinh thái ngập mặn Cần Giờ Nhà Bè
6
Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong
quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể
này thích nghi hơn với những thay đổi môi trƣờng.
2.2.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bảo vệ sự đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là đòi hỏi của bất kỳ loài nào để đảm bảo sự sinh sản, chịu
đựng bệnh tật và khả năng thích nghi với điều kiện môi trƣờng luôn luôn thay đổi.
Bảo tồn nguồn gen không chỉ nhằm ngăn chặn sự tuyệt chủng của một loài mà
bảo tồn nguồn gen còn nhằm ngăn chặn sự mất mát của các gen, các phức hợp gen và
các kiểu hình, ngăn chặn sự tuyệt chủng các nòi địa lý (landraces) mà vốn gen của
chúng bị suy giảm nghiêm trọng tới mức một số gen và một số phức hợp gen có thể bị
mất đi, tiềm năng di truyền của loài bị giảm mạnh, và trong trƣờng hợp xấu nhất là sự
tuyệt chủng của loài.
2.3. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây mắm đen
Tên Việt Nam: Cây mắm đen
Tên Latin: Avicennia officinalis
Giới (regnum): Plantae
Ngành (divisio): Magnoliophyta
Lớp (class): Magnoliopsida
Bộ (ordo): Lamiales
Họ (familia): Avicenniaceae
Chi (genus): Avicennia
2.3.1. Hình thái học
Hình dáng : Cây mắm đen cao tối đa có thể tới 20 m, đƣờng kính đến 0,7 m,
thân hình trụ, tƣơng đối suôn, có khi thẳng với thân trụ cao 6 – 10 m, cành non có lông
tơ trơn, vỏ mỏng không nứt màu xám đen, rễ phổi hình đũa, thƣờng chia đôi. [11] 8
tiểu nhị, bầu noãn hình nón, có lông trắng mịn, vòi nhụy hình sợi dài trắng, có lông
rậm, đầu nhụy chẻ hai, uốn cong. [11]
Trái: Trái là manh nang hình trứng gốc tròn, đầu có mũi nhọn, dài 2 – 3 cm có
khi đến 3,8 cm. Mầm xanh đỏ dợt, vỏ đầy lông vàng mịn, 01 hột, không phôi nhũ, nẩy
mầm trƣớc khi trái rụng. [11]
Hình 2.3. Trái của cây mắm đen
2.3.2. Phân bố
Rừng Sát Việt Nam (Cà Mau, Long Hải) Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Philippin,
Malaixia, Inđônexia, Nouvelle Guinee, Saloman, Caroline,... là loại cây ƣa sáng, sinh
trƣởng nhanh, thuộc loại chịu đất kiềm, thích nghi với các loại đất (bùn, cát, sét) và
các độ mặn của nƣớc (mặn, lợ, ngọt), cho chồi gốc. Tại Cà Mau, cây trổ hoa vào đầu
mùa mƣa (4 - 6 dƣơng lịch), cho trái vào cuối mùa mƣa (9 - 11 dƣơng lịch), vài giờ
sau khi rụng, cây mầm hút nƣớc lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài. Rừng sát Việt
Nam thƣờng chiếm những diện tích mới bồi ven biển, mực thủy triều lên xuống hàng
ngày. Nói chung, "Ðất bùn có nƣớc triều lên xuống hàng ngày" là đất sinh trƣởng, phát
triển thích hợp của loài cây gỗ này. Tại Cà Mau, cây có thể cao đến 22 – 25 m với đƣờng
kính 15 – 20 cm. [11]
2.3.3. Vai trò của rừng mắm đen
Mắm đen là loại cây có sinh khối lớn, gỗ mắm đen đƣợc sử dụng rộng rãi đóng
nhà cửa, đóng vật dụng, làm bè thuyền, cung cấp nguyên liệu cho làm giấy, nguyên
liệu cho làm dƣợc phẩm, cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da. [15]
9
Đặc điểm của cây mắm đen là có rễ đất và rễ phổi. Rễ phổi có nhiệm vụ hấp thụ
dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phổi cũng là "kiến trúc" của
Các base tạo nên các nucleotid của DNA là A, G, C, và T. Các base tạo nên
nucleotid của RNA là A, G, C và U.
10
Phân tử DNA thông thƣờng đƣợc tạo bởi hai chuỗi nucleotid, trong khi đó RNA
thông thƣờng chỉ có một chuỗi. Tuy nhiên, có vài trƣờng hợp ngoại lệ RNA của
một số virus có hai chuỗi nucleotide.
Ở sinh vật Eucaryote, thông tin di truyền là phân tử DNA, là một chuỗi xoắn
kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide. Mỗi nucleotide gồm
nhóm phosphate, đƣờng deoxyribose và một trong bốn loại base (A, C, G, T). Hai
mạch đơn liên kết với nhau nhờ liên kết hydro, giữa NH
2
và CO, N và NH. Do đó, A
bổ sung cho T có hai nối hydrogen, G bổ sung cho C có ba nối hydrogen, tỷ lệ giữa
A/T=1 và G/C=1. Tuy nhiên, tỷ lệ (A+T)/(G+C) rất hay thay đổi giữa các DNA khác
nhau và đặc trƣng cho loài. Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hƣớng với một đầu
là 5’ phosphate tự do và một đầu là 3’ hydroxyl tự do (hƣớng quy ƣớc là 5’ 3’).
Hƣớng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép ngƣợc nhau và gọi chúng là hai mạch
đối song song. Hai mạch đơn liên kết với nhau bởi tính chất bổ sung. Chính tính chất
này giải thích đƣợc cấu trúc chặt chẽ của phân tử DNA, đặc biệt là cách thức tự sao
chép để tạo ra hai phân tử con từ một phân tử. [9]
2.4.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA
Phƣơng pháp tách triết DNA cơ bản gồm ba bƣớc:
Bƣớc1: Phá màng tế bào và màng nhân (Eucaryote). Thông thƣờng ngƣời ta
nghiền tế bào, mô trong hợp chất tẩy (nhƣ SDS, sarcosyl) và Proteinase (Proteinase
K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng
đồng thời phá hủy các protein liên kết với DNA.
Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật
độ quang (OD: Optical density) ở bƣớc sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác
định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tƣơng quan: 1 đơn vị OD
260nm
tƣơng ứng
với nồng độ 50 µg/ml cho dung dịch chứa DNA mạch kép và 40 µg/ml cho một dung
dịch RNA hay DNA sợi đơn.
Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch. Để
kiểm tra độ sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị OD
280nm
. Tại bƣớc sóng
280 nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, nhƣng các protein cũng hấp thu bƣớc sóng ở
260 nm nhƣ các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic
acid. Tỉ số OD
260nm
/OD
280nm
là tỉ số cho thấy độ tinh sạch của DNA. [5]
Tỉ số OD
260nm
/OD
280nm
= 1,8 đối với DNA tinh khiết.
Tỉ số OD
260nm
/OD
280nm
= 2 đối với RNA tinh khiết. 13
Hình 2.4. Nguyên tắc phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm 3 bƣớc:
Bƣớc 1: Biến tính.
Giai đoạn này đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao (94 – 95
0
C) trong vòng 30 giây
đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch
đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bƣớc 2: Bắt cặp.
Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer bắt cặp với các mạch của DNA khuôn
theo nguyên tắc bổ sung.
Ở giai đoạn này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với DNA
khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 – 70
0
C, kéo dài trong khoảng 30 giây
đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy T
m
(melting temperature) của các primer
sử dụng. Giai đoạn này gọi là giai đoạn lai.
Bƣớc 3: Kéo dài dây mới nhờ primer.
Nhiệt độ đƣợc tăng lên 72
0
C giúp cho Taq DNA polymerase hoạt động tốt nhất.
Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thƣờng
kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Một chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả sau cùng ta
Độ dài của đoạn mồi là 17 - 25 nucleotide (cho PCR bình thƣờng).
2.5.4. Ƣu điểm và nhƣợc điểm
Ƣu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, đặc hiệu, chỉ cần một lƣợng mẫu nhỏ có
thể thực hiện.
Nhƣợc điểm: Có thể cho phản ứng dƣơng tính dã, không phân biệt đƣợc sinh
vật sống hay chết.
2.6. Một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học
2.6.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Trong số các chỉ thị phân tử, chỉ thị RFLP đƣợc sử dụng đầu tiên trong việc lập
bản đồ gen của con ngƣời (Botstein và ctv, 1980), sau đó đƣợc cải biên để ứng dụng
cho việc lập bản đồ (mapping) ở cây trồng. RFLP là thể đa hình đáng tin cậy nhất, có
thể đƣợc dùng cho những phân tích chính xác về kiểu gen.
RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình về chiều dài các đoạn cắt giới hạn, biểu
hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc cắt bằng các enzyme cắt
giới hạn.
Copyright: Tài liệu đại học ©