BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN
CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG
(Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN
RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
BẰNG KỸ THUẬT RAPD
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHƢỚC DOANH Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8 / 2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH


Con muốn hôn lên đôi vầng trán đã nhiều nếp nhăn của Cha Mẹ để bày tỏ
lòng yêu thƣơng của con với ngƣời. Suốt cuộc đời này con xin mãi khắc ghi công
ơn sinh thành, dƣỡng dục của Cha Mẹ đã nuôi dƣỡng con khôn lớn và cho con ăn
học nên ngƣời. Con rất muốn Cha Mẹ biết rằng con yêu Cha Mẹ nhiều lắm, con
luôn tự hào vì là con của Cha Mẹ.
Con xin chân thành biết ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn
động viên và tạo điều kiện cho con ăn học đến ngày hôm nay.
Em xin gởi lòng biết ơn đến:
 Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
 Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trƣờng Đại Học Nông
Lâm TP Hồ Chí Minh.
 Ban Chủ nhiệm và các Thầy, Cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học.
 Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ, anh Bình, anh Kiệt thuộc phòng
kỹ thuật.
đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực hiện đề tài này.
Em xin đặc biệt gởi lòng biết ơn và tri ân sâu sắc đến Thầy - Tiến sỹ Bùi
Minh Trí – giáo viên hƣớng dẫn, đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ và truyền đạt nhiều
kinh nghiệm quý giá trong nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống, giúp em hoàn
thành đề tài này và ứng dụng nhiều trong thời gian tới.
Và rất cảm ơn đến các anh chị đang công tác tại Trung tâm phân tích Thí
nghiệm Trƣờng Đại học Nông Lâm: chị Hƣng, chị Dung, chị Liên, anh Khoa, anh
Phƣơng, anh Vũ…cùng các bạn sinh viên Công nghệ sinh học K29 thƣơng yêu, đã
cùng tôi chia sẽ nhiều buồn vui, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn !

NGUYỄN PHƢỚC DOANH

iv
TÓM TẮT KHÓA LUẬN

SUMMARY

NGUYEN PHUOC DOANH, Nong Lam university. “PREMILINARY RESEACH
ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION
OF Avicennia alba IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA
USING RAPD”.
This thesis was carried out at Chemical & Biological Analysis And Experiment
Center, Nong Lam university from April to August 2007.
Avicennia alba is an important true mangrove species because of it’s large
distribution, especially in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Area. However,
over – exploitation by human activities has induced to a steady decline and
degraduation. Studies on population genetics are necessary to provide basic
information for establishing the strategies for conserving and recovering
biodeversity of the ecosystem.
The obtained results were:
 Fifty of Avicennia alba leaf samples were collected.
 The genome DNA isolation protocol was improved to get high quality DNA.
 The RAPD – PCR procedure was developed and optimized suitable for
Avicennia alba using primer OPAC10. Totally 49 amplicons were
generated with an average of 3,5 applicons per individual. There were only
one isomorphic băng (200 bps) and six polymorphic băngs (50 bps, 100 bps,
300 bps, 330 bps, 390 bps, and 450 bps).
 A phylogenic tree was drawn by using NTSYS sofware based on RAPD
results. This phylogenic shown a high coefficient similarity from 0.55 to 1 in
14 analized samples. It suggested that the genetic diversity of Avicennia alba
population is relatively poor. So, strategies for conserving and recovering
their genetic diversity in Can Gio biodiversity is urgently needed.

vi
MỤC LỤC

2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền ......................................................................... 14
2.3.1. Đa dạng sinh học ............................................................................................ 14
2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học .......................................... 14
2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................ 15
2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái ..................................................................................... 15
2.3.3.2. Đa dạng loài ................................................................................................. 15
2.3.3.3. Đa dạng di truyền ......................................................................................... 16
2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam ........................................................ 17
2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật ............................................................. 18
2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................... 19
2.5.1 Khái niệm ........................................................................................................ 19
2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR .............................. 19
2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................................... 20
2.5.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR .......................................................................... 21
2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................. 21
2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền .................... 22
2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .............................................. 22
2.6.2. Nhóm dựa trên PCR ........................................................................................ 23
2.6.2.1. SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) ............................... 23
2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) .......................................... 24
2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................. 25
2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................................ 30
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ....................................... 33
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ......................................................................... 33
3.1.1. Thời gian tiến hành ......................................................................................... 33
3.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 33
3.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 33
3.2.1. Mẫu thực vật.................................................................................................... 33



ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 3.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ................... 40
Bảng 3.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ............................... 40
Bảng 3.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ................ 41
Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ............................... 41
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 ............................................................ 47

x
DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................. 5
Hình 2.2. Cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. ................................. 11
Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng. ......................................................................... 12
Hình 2.4. Trái mắm trắng. ......................................................................................... 12
Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. ..................................................... 20
Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI .................................................... 26
Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. ...................................... 26
Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. .......................... 27
Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. ................................. 28
Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP ................................................... 29

 PCR: Polymerase chain reaction
 pmol: picomol
 RNA: Ribonucleic acid
 Rnase: Ribonuclease
 SSR: Single sequence repeat
 Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)
 TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid
 TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)
 Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)
 U: Đơn vị hoạt tính của enzyme
1

Phần 1
GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề
Rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, đƣợc xem là khu rừng phục hồi
đẹp nhất Đông Nam Á và vinh dự đƣợc UNESCO công nhận là khu dự trữ sinh
quyển đầu tiên của Việt Nam, nằm trong mạng lƣới 459 khu dự trữ sinh quyển trên
Thế giới. Đây đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt
đới, không chỉ phong phú, đa dạng với các quần thể thực vật, động vật có giá trị mà
còn đƣợc xem là lá phổi xanh của TP Hồ Chí Minh và có nhiều tiềm năng về kinh
tế, du lịch sinh thái – văn hóa, nghiên cứu và giao lƣu quốc tế.
Cây mắm trắng (Avicennia alba) là một trong những loài thực vật ngập mặn
thực sự, rất phổ biến tại rừng Cần Giờ. Đây là quần thể tiên phong và giữ một vai
trò quan trọng trong hệ sinh thái rừng. Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong
việc khai thác gỗ mà nằm trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trƣờng sống cho sinh
vật ven biển. Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đƣớc là thành phần chính
của rừng ngập mặn Cần Giờ, có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven biển, là nơi
nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao. Diện tích đất bồi

 Việc tìm kiếm những cá thể đặc biệt bị giới hạn do điều kiện đi lại trong
rừng gặp nhiều khó khăn.
 Đề tài đƣợc thực hiện trong thời gian ngắn, từ tháng 4/2007 đến tháng
8/2007, do đó chƣa phản ánh đúng đắn và chính xác với tất cả các giống hiện có.

3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ
2.1.1. Đặc điểm tự nhiên
Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ nằm trên địa bàn huyện Cần Giờ, một huyện
ngoại thành của TP Hồ Chí Minh, nằm ở vùng ven biển vịnh Gềnh Rái và cửa sông
Đồng Nai, là cửa ngõ Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành
phố khoảng 30 km. Đây là khu dự trữ sinh quyển mang đặc điểm của hệ sinh thái
cửa sông ven biển, hệ động thực vật đặc trƣng cho hệ sinh thái rừng ngập mặn.
Vùng rừng ngập mặn bị chia cắt bởi hệ thống sông rạch dày đặc gồm sông lớn nhƣ
Lòng Tàu nằm giữa khu rừng (đƣờng thủy ra vào cảng Sài Gòn), sông Đồng Tranh,
sông Nhà Bè, sông Thị Vải, sông Gò Gia, và nhiều rạch khác [19].
Trƣớc năm 1960, rừng ngập mặn Cần Giờ (có tên gọi thông thƣờng là Rừng
Sác) có tới hơn 40.000 ha cây rừng, đƣợc xếp hạng rừng giàu. Rừng có cấu trúc dày
đặc với tán rừng dày, cao trên 25 m, đƣờng kính 25 – 40 cm, là sinh cảnh của nhiều
động vật hoang dã. Trong rừng, đƣớc (Rhizophora apiculata) là loài chiếm ƣu thế,
bên cạnh các quần thể khác nhƣ bần đắng (Sonneratia alba), mắm trắng (Avicennia
alba), đƣng (R. mucronata), vẹt (Bruguiera spp.), xu (Xylocarpus spp), cóc
(Lumnitzera spp.), chà là (Phoenix paludosa), giá (Excoecaria agallocha) [5], [19].
Trong suốt thời gian chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ là đối
tƣợng tàn phá của nhiều phƣơng tiện chiến tranh, đặc biệt bị hủy diệt gần nhƣ hoàn
toàn do chất độc hóa học, liên tục từ năm 1961 đến năm 1971, hầu hết các loại cây

54,2%).
 Dân số: 57.650 ngƣời (nguồn thống kê tháng 7/1999 của huyện Cần
Giờ), với 40% số hộ thuộc diện xóa đói giảm nghèo, sống chủ yếu dựa vào
khai thác tài nguyên rừng [5], [8], [19].

5 Hình 2.1. Bản đồ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Ghi chú:
Vùng lõi
Vùng đệm
Vùng chuyển tiếp
6

2.1.2. Cấu trúc

phục vụ cho du lịch sinh thái. Ngoài ra, các mô hình lâm ngƣ kết hợp thân thiện với
môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng, trình diễn cho nhân dân địa phƣơng đến tham
quan, học tập và trao đổi kinh nghiệm [5].
Vùng chuyển tiếp (29.310 ha): gồm các khu vực còn lại của huyện Cần
Giờ, bao gồm các vùng bãi bồi, giồng, bãi cát, các khu vực sản xuất nông nghiệp,
thuỷ sản của dân cƣ dọc theo ven biển Cần Giờ.
Vùng chuyển tiếp còn đƣợc gọi là vùng phát triển bền vững, nơi cộng tác của
các nhà khoa học, nhà quản lý và ngƣời dân địa phƣơng, tạo điều kiện thuận lợi và
đẩy mạnh các hoạt động phát triển kinh tế, du lịch, dịch vụ đi đôi với tuyên truyền
giáo dục nâng cao nhận thức cộng đồng [5].
2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ
Rừng ngập mặn Cần Giờ là Khu dự trữ sinh quyển thế giới đầu tiện tại Việt
Nam, và là thành viên thứ 368 của mạng dự trữ sinh quyển quốc tế thuộc 97 quốc
gia. Đến tháng 7/2002, Rừng ngập mặn Cần Giờ tiếp tục đƣợc Tổ chức Du lịch thế
giới (World Tourism Organization) công nhận là Khu du lịch Sinh thái bền vững
nhất (là 1 trong 65 khu đƣợc thế giới công nhận). Theo Ủy ban Quốc gia Con ngƣời
và Sinh quyển Việt Nam (MAB), rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc xem là khu rừng
phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á, đặc biệt là còn rất ít trên thế giới [5], [19].
Rừng ngập mặn đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven
biển nhiệt đới không chỉ cung cấp lâm sản có giá trị mà còn là nơi cƣ trú của nhiều
loài hải sản, chim nƣớc, chim di cƣ và một số loài động vật lƣỡng cƣ, trên cạn [19].
Rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính chất rừng nhiệt đới cổ và phong phú về
số loài thực vật di cƣ. Theo số liệu điều tra, Rừng ngập mặn Cần Giờ có khoảng 35
loài thực vật, phổ biến là đƣớc đôi (Rhizophora apiculata), đƣng (Rhizophora
mucronata), mắm trắng (Avicennia alba), bần (Sonneratia evata), chà là (Phoenix
paludosa), dừa nƣớc (Nipa fruticans) [19].
8

Cùng với sự phục hồi về thảm thực vật rừng, nhiều loài động vật tƣởng
chừng đã biến mất cùng với sự tàn phá của chiến tranh đã hồi sinh và phát triển lại

Các khu dự trữ sinh quyển là đại diện mẫu của các hệ sinh thái trên Trái đất,
là phòng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh thái, đem lại
lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng và Quốc tế [5].
Hiện nay trên thế giới có 459 khu dự trữ sinh quyển thuộc 97 nƣớc [5]. Khu
dự trữ sinh quyển có các chức năng sau:
 Bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn địa dạng cảnh quan, hệ sinh thái
loài và vốn gien di truyền.
 Phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế dựa trên cơ sở bền vững môi
trƣờng và văn hóa.
 Trợ giúp: nghiên cứu, giám sát, đào tạo và giáo dục về bảo tồn và phát
triển bền vững địa phƣơng, Quốc gia, khu vực và Quốc tế.
2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ
Trong chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ bị hủy diệt gần nhƣ hoàn toàn do
chất độc hóa học của Mỹ. Hầu hết các loại cây rụng lá và chết. Các loài cây chính
của rừng nhƣ đƣớc, đƣng gần nhƣ bị biến mất [19].
Sau chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc tái sinh theo kế hoạch trồng
và phát triển rừng của thành phố Hồ Chí Minh, nhanh chóng trở thành Khu rừng
phòng hộ (1991) và Khu dự trữ sinh quyển thế giới (2000). Tuy nhiên hiện nay rừng
ngập mặn Cần Giờ đang đứng trƣớc những nguy cơ đe dọa đáng báo động [21].
Việc nghiêm cấm tỉa thƣa rừng của Ủy ban Nhân dân thành phố Hồ Chí
Minh ban hành (6/1999) làm chất lƣợng rừng có xu hƣớng xấu đi, do cạnh tranh
không gian, dinh dƣỡng và tạo điều kiện cho sâu bệnh phát triển. Chiều cao của cây
quá cao (với tuổi đời 19 – 27 chiếm đa số), cộng với thiếu ánh sáng nên đƣờng kính
thân không cân đối, làm thiệt hại đáng kể đến thu nhập từ nguồn gỗ. Mặc khác, việc
lƣu thông tàu bè đã làm xói lở ven bờ, khói thải, dầu làm ảnh hƣởng đến môi sinh.
Nhiều hộ dân cƣ vẫn còn sinh sống và sản xuất trong rừng làm ảnh hƣởng đến dòng
chảy, nguồn nƣớc, tạo các dịch bệnh cho cây rừng. Hiện nay đã xuất hiện nhiều sâu
10

bệnh hại cây rừng, nhƣ sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân đe dọa nghiêm trọng đến

thẳng, với nhiều cành nhánh cong queo, chỉ khá thẳng khi mọc lẫn với rừng đƣớc
(Rhizophora apiculata), vỏ nâu dợt đến xám đen, tròn, nhiều nốt bần [17].

Hình 2.2. Cây mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ.
Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến hình mác, thuôn, bầu dục, dài 5 – 7 cm, rộng từ
2,5 – 3 cm, đầu nhọn có khi tù, chân nêm, mặt dƣới phủ lông màu trắng bạc, gân
bên nổi rõ cả hai mặt, có tuyến tiết muối thƣa ở cả mặt dƣới và mặt trên, lá khô có
màu đen ở mặt trên [17].
12

Hoa: nhỏ 5 – 8 mm, vàng cam, tạo thành tán - gié ở ngọn, hoa từng cặp, lá
bắc nhỏ, không cọng, đài ngắn, không rụng, 5 tai đài hình bầu dục, có 2 lõm, đài

nhiều loại đất (bùn, cát, sét) và các độ mặn của nƣớc (mặn, lợ, ngọt). Mắm trắng là
loài cây cho chồi gốc, thƣờng trổ hoa vào đầu mùa mƣa (tháng 4 – 6 dƣơng lịch),
cho trái vào cuối mùa mƣa (tháng 9 – 11 dƣơng lịch). Chỉ vài giờ sau khi trái rụng,
cây mầm bên trong hút nƣớc lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài và phát triển thành
cây mới. Mắm trắng thƣờng chiếm những diện tích mới bồi ven biển, nơi có mực
thủy triều lên xuống hàng ngày. Nói chung "Ðất bùn có nƣớc triều lên xuống hàng
ngày" là đất sinh trƣởng, phát triển thích hợp của loài cây gỗ này [15].
2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng
Đặc điểm của cây mắm là có rễ đất và rễ phổi. Rễ phổi có nhiệm vụ hấp thụ
dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phổi cũng là "kiến trúc"
của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi [15].
Gỗ cây mắm trắng trƣớc đây dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi. Ngày
nay mắm cũng cung cấp nguyên phẩm cho việc biến chế dƣợc liệu và cung cấp sắc
tố cho công nghiệp thuộc da. Vì thiếu nguồn cây giống để trồng bảo vệ ven biển và
đất bồi, một số nƣớc đã có lệnh cấm xuất khẩu gỗ và cây con các loại cây mắm,
đƣớc và vẹt [17].
Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm ở lợi
ích trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trƣờng sống cho sinh vật ven biển. Quần
thể mắm trắng đi kèm với quần thể đƣớc là thành phần chính của rừng ngập mặn có
vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven là nơi nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho
các loài hải sản có giá trị cao. Diện tích đất bồi sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ
(riêng Cà Mau vài km²/năm) [15].
2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ
Trong tƣơng lai gần quần thể mắm trắng tại Cần Giờ sẽ lâm vào tình trạng
nguy cấp do khai thác bừa bãi quá mức, không có kế hoạch, chặt cây phá rừng lấy
đất làm đầm nuôi tôm và sản xuất nông nghiệp khác [16].
14

Bên cạnh đó việc phá rừng, phóng đƣờng đã và đang gây nhiều ảnh hƣởng
đến diện tích và môi sinh của cây mắm trắng. Do đó mặc dù diện tích rừng và trữ