CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM,
NUÔI CẤY, PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN NẤM –
PHẦN 1 4.1. Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm:
Trong la bo xét nghiệm chẩn đoán nấm thì công việc lấy mẫu rất quan trọng,
phục vụ cho việc xét nghiệm trực tiếp hoặc cho nuôi cấy phân lập. Kết quả xét
nghiệm phụ thuộc vào cách lấy mẫu từ bệnh nhân.
+ Những điều cần lưu ý:
- Khi sử dụng những dụng cụ lấy mẫu cần phải tiệt trùng để tránh nhiễm khuẩn
hoặc nấm mốc từ môi trường xung quanh, nếu không sẽ gây khó khăn cho việc xét
nghiệm cũng như nuôi cấy.
- Khoảng 10 ngày trước khi lấy mẫu bệnh nhân không được sử dụng thuốc
chống nấm.
- Khi soi phải quan sát ít nhất 30 vi trường trước khi kết luận.
+ Kỹ thuật lấy bệnh phẩm ở các vị trí khác nhau:
- Bệnh phẩm ở da: cạo lấy phần da cạnh chỗ bị nhiễm, trên bờ viền thường cho
kết quả tốt. Ngoài ra có thể sử dụng một loại băng dính đặt vào chỗ da nhiễm nấm
(như lang ben) rồi kéo ra soi hoặc cho vào môi trường nuôi cấy, kết quả thường
cao hơn phương pháp cạo vẩy khoảng 10%.
- Bệnh phẩm ở ngón chân: có thể dùng kéo, kẹp hoặc đầu mũi dao tù cạo lấy
mẫu từ chỗ da ngón chân bị nhiễm. Trong trường hợp da ngón chân không bị nứt
nẻ thì cần lấy những phần vẩy da đang bong để xét nghiệm.
- Bệnh phẩm ở móng tay: cần cạo móc lấy những mảnh vụn tơi ở dưới móng
bằng một dụng cụ có đầu tù để tránh bị đau.
- Bệnh phẩm ở tóc, ở da đầu: cắt lấy một ít tóc, nhổ chân tóc hoặc cạo ít vẩy da
ở chỗ bị nhiễm nấm xét nghiệm.
4.2. Phương pháp soi bệnh phẩm trực tiếp trong dung dịch KOH 20-30%:
+ Các bệnh phẩm là sợi tóc, mẩu vụn móng tay, vẩy da được đặt lên lam
kính có 1 - 2 giọt dung dịch KOH 20%, hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, dưới

0
C trong 10-15 phút, để nguội khi nhiệt độ còn
khoảng 50
0
C cho 250.000 đơn vị penicilin, 250 mg streptomycin và 500 mg
actidion vào quấy đều, đóng vào ống nghiệm hoặc hộp lồng. Môi trường này được
dùng để cấy những mẫu bệnh phẩm vào để phân lập xác định nấm da.
- Môi trường Sabouraud có cloramphenicol và desertomycin: thành phần môi
trường Sabouraud như trên. Sau khi hấp tiệt trùng xong cho 50 mg cloramphenicol và
500 mg desertomycin vào quấy đều rồi cho vào ống nghiệm hoặc hộp lồng. Có thể
cho vào trước khi tiệt trùng trong nồi hấp cũng được vì hai chất này chịu nhiệt. Sử
dụng môi trường này cũng giống như môi trường trên.
- Môi trường Mycosel:
. Thành phần: Pepton 10 gam.
Glucoza 10 gam.
Thạch 15 gam.
Cycloheximid 0,4 gam.
Cloramphenicol 0,05 gam.
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
. pH của môi trường sau khi tiệt trùng là 6,9. Cloramphenicol bền vững với
nhiệt nên được cho vào trong môi trường rồi tiệt trùng 121
0
C trong 15 phút. Sau
khi môi trường nguội khoảng 45-50
0
C thì cho actidion vào. Actidion được hoà tan
trong etanol hoặc aceton, lọc qua phễu lọc cản trùng rồi đưa vào môi trường trên,
lắc đều và cho vào ống nghiệm để nghiêng hoặc vào hộp lồng. Môi trường bảo
quản trong tủ lạnh dùng dần.
+ Nutritional test:



T.rubrum 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+
T.mentagrophytes 4+ 4+ 4+ 4+ 4+
T.equinum 0 0 0 0 4+
T.equinum
Chủng New
Zealand
4+ 4+ 4+ 4+ 4+
T.soudanense 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 0 0
T.megninii 2+ 0 4+
T.gallinae 3+ 4+ 4+
*. Base medium: môi trường cơ sở.
1. Thêm inositol. 2. Thêm inositol thiamine.
3. Thêm thiamine. 4. Thêm nicotinic acid. 5. Thêm histidine.
+ Môi trường DTM (Dermatophyte Test Medium): dùng để xét nghiệm một
mẫu bệnh phẩm nghi ngờ có nấm da hay không. Khi nuôi cấy nấm da trong môi
trường này ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần, nếu môi trường chuyển màu từ đỏ sang
vàng là nấm da.
- Thành phần môi trường:
Phytone 10 gam.
Glucose 10 gam.
Thạch 20 gam.
Dung dịch đỏ phenol 40 ml.
HCl 0,8 N 6 ml.
Cycloheximid 0,5 gam.
Gentamycin sulfat 0,1 gam.
Chlortetracycline HCl 0,1 gam.
Nước 1000 ml.
- Cho phenol, glucose, thạch vào nước, đun sôi để hòa tan thạch. Cho 40 ml

đất một lớp tóc người đã cắt nhỏ. Sau đậy nắp hộp lồng, đặt vào chỗ tối và để ở
nhiệt độ phòng khoảng 20-25
0
C, hàng tuần kiểm tra xem nấm mọc chưa.
+ Kết quả: thường sau 3-4 tuần nấm phát triển tốt trên các sợi tóc, màu hơi
trắng hoặc hơi vàng nâu tùy thuộc từng loài nấm (hình 4.2). Trong một số trường
hợp dạng sinh sản hữu tính cũng được hình thành trên những sợi tóc. Khi có nấm
mọc thì ta dùng kẹp lấy một vài sợi tóc có nấm mọc đặt lên lam kính có một giọt
nước hay lactophenol, đậy lamen rồi soi dưới kính hiển vi, dựa vào hình dạng của
nấm có thể định danh được loài nấm da. Tuy nhiên ta cần nuôi cấy nấm trên vào
môi trường Sabouraud có chứa kháng sinh để tiếp tục định danh nấm.

1 2
Hình 4.2: Nấm da phân lập từ đất, theo phương pháp bẫy tóc.
1. M.gypseum, phát triển sau 5 tuần.
2. T.ajelloi, phát triển sau 5 tuần.
4.5. Phương pháp nuôi cấy vi thể trên lam kính (microculture):
Ballagi đã đưa ra phương pháp nuôi cấy nấm trên lam kính để nghiên cứu các
cơ quan khác nhau của nấm như các cơ quan sinh sản vô tính và các cơ quan khác.
Do đó, người ta đã nghiên cứu nấm một cách rõ ràng, đầy đủ và không bị dập nát.
Người ta đã ứng dụng phương pháp này nhiều trong nghiên cứu phân loại xác định
các loài nấm da.
Phương pháp này được cải tiến như sau:
+ Chuẩn bị hộp lồng: sử dụng lam kính sạch và tiệt trùng bằng cách hơ đi hơ
lại vài lần trên ngọn lửa đèn cồn. Đặt lên một que thủy tinh uốn thành hình chữ U
ở trong hộp lồng, bên trong hộp lồng đặt một miếng bông hoặc giấy có thấm nước
cất để duy trì độ ẩm tạo điều kiện cho nấm phát triển tốt.
+ Chuẩn bị thạch: dùng cái khoan đục lỗ hoặc cắt thạch thành những hình
vuông kích thước 5-10 mm, cao khoảng 3 mm. Đặt thạch vào giữa lam kính.
+ Dùng que cấy nấm vào bề mặt và xung quanh khoanh môi trường, dùng
Hình 4.4: Cơ quan “đâm chọ
c”
(cái khoan) của nấm trong sợi tóc.
Hình 4.5: Test xuyên tóc (phương pháp
của Thammayya, Ajello, Galgoczy).
1. Sợi tóc; 2. Nấm được cấy vào; 3. Giọt thạch.

4. Hộp lồng; 5. Miếng bông thấm ướt.

sinh ở dạng lỏng, nhỏ từng giọt riêng biệt vào đáy một hộp lồng vô trùng, để cho
đông lại. Dùng một kẹp vô trùng đặt vào mặt giọt thạch vài sợi tóc (chuẩn bị như
phương pháp bẫy tóc), sau đó cấy nấm lên trên, lật ngược hộp lồng lên và phía
dưới cũng đặt một miếng bông thấm nước để giữ ẩm môi trường (hình 4.5). Để ở
nhiệt độ phòng, hàng ngày kiểm tra sợi tóc dưới kính hiển vi để quan sát sự tạo
thành cơ quan “đâm chọc” của nấm.
+ Phương pháp thứ hai: cho 20-30 ml nước tiệt trùng vào hộp lồng đã có 10-20
sợi tóc, thêm 2-3 giọt dịch chiết men 10% vào hộp lồng. Cấy một ít nấm vào dung
dịch, đậy nắp, ghi nhãn và để ở nhiệt độ phòng. Sau 2-4 tuần kiểm tra.
4.7. Những phương pháp kiểm tra hình dạng vi thể của nấm:
4.7.1. Kiểm tra hình dạng nấm in situ:
Trong một số trường hợp có thể kiểm tra trực tiếp hình dạng của nấm ngay trên
khuẩn lạc trong hộp lồng hoặc ngay trong ống nghiệm. Với độ phóng đại và ánh sáng
thích hợp có thể quan sát thấy các cơ quan của nấm và có thể nhận xét ban đầu về
một loài nấm.
Phương pháp: đặt ống nghiệm nằm ngang trên bàn của kính hiển vi và điều
chỉnh vật kính ra rìa của ống nghiệm (có thể soi trực tiếp một khuẩn lạc nấm trong
hộp lồng với một lớp môi trường mỏng) có thể thấy đầy đủ các cơ quan của nấm
như bào tử nhỏ, bào tử lớn, bào tử áo cũng như các vòng xoắn của nấm. Dựa vào

nấm như bào tử lớn, bào tử nhỏ, thành tế bào, bề mặt của bào tử hay vách ngăn
của nấm người ta thường nhuộm nấm với một trong các dung dịch thuốc nhuộm sau:
+ Thuốc nhuộm xanh cotton C4B:
Lactophenol 100 ml.
Xanh cotton 0,5 gam.
+ Thuốc nhuộm xanh cotton bão hoà Sudan:
Lactophenol bão hoà Sudan 100 ml
Xanh cotton 0,5 gam.
+ Dung dịch nhuộm Fuchin:
Fuchin bão hoà trong dung dịch cồn và nước: 4 ml.
Xanh methylen bão hoà trong dung dịch cồn và nước: 2 ml.
Nước cất: 27 ml.
+ Dung dịch đỏ Công Gô:
Đỏ Công Gô 0,1 gam.
Amonium hydroxit 10% 100 ml.
Với dung dịch này dưới kính hiển vi có ánh sáng phân cực (plazizacios) thì độ
dày của thành tế bào hay độ dày của bào tử áo quan sát rất rõ.
4.7.7. Phương pháp PAS nhuộm nấm ở tổ chức:
Khi nhuộm tổ chức theo phương pháp hematoxylin thường không thấy rõ nấm,
muốn phân biệt nấm với các tổ chức khác của cơ thể người hoặc động vật người ta
thường nhuộm tiêu bản với thuốc nhuộm Schiff (còn gọi là PAS).
+ Các bước chuẩn bị thuốc nhuộm:
- Dung dịch axit Periodic (HJO
4
) 1%:
(HJO
4
) 1%.
Nước cất vừa đủ 100 ml.
Dung dịch cần bảo quản nơi tối và có thể sử dụng lâu dài.

- Ngâm tiêu bản vào dung dịch Periodic trong 20 phút.
- Rửa tiêu bản bằng nước máy chảy liên tục trong 5 phút.
- Nhuộm tiêu bản trong thuốc nhuộm Schiff 15 phút.
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch axit sulfuric trong 5 phút.
- Nhúng lại tiêu bản vào dung dịch axit sulfuric khác trong 5 phút.
- Nhúng tiêu bản vào cốc, đặt dưới vòi nước máy chảy liên tục 8 phút.
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch Lichgrun trong 2-5 phút.
- Tráng tiêu bản bằng nước máy trong 1 phút.
- Tráng tiêu bản bằng cồn 96% trong phút.
- Tráng tiêu bản bằng xilon trong 1 phút.
- Cuối cùng nhỏ 1 giọt gôm Canada lên lam kính rồi đặt lamen nhỏ, mỏng lên
trên, tiêu bản có thể giữ hàng năm.
+ Kết quả: khi soi nấm bắt màu đỏ, tế bào của tổ chức bắt màu xanh.
4.8. Phương pháp phân biệt bào tử lớn với các cơ quan khác của nấm:
+ Thuốc nhuộm:
Dung dịch axit Fuchin trong lactophenol.
Dung dịch Lichgrun 1%.
+ Cách nhuộm:
- Cố định chất nấm trên lam kính bằng cồn methylic trong 5 phút.
- Cho vài giọt thuốc nhuộm Fuchin lactophenol vào tiêu bản, để yên 1-2 giờ.
- Tráng tiêu bản vào dung dịch axit sulfuric 1-2 phút.
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch Lichgrun trong 5 phút.
- Dùng giấy thấm đặt lên tiêu bản loại dung dịch Lichgrun thừa.
- Gắn tiêu bản bằng nhựa gôm Canada rồi soi kính.
+ Kết quả: bào tử lớn của nấm da bắt màu đỏ còn các sợi nấm và bào tử nhỏ
bắt màu xanh phân biệt rất rõ rệt trên tiêu bản.
4.9. Phương pháp gây nhiễm nấm trên động vật thí nghiệm:
Để nghiên cứu khả năng gây bệnh của các loài nấm da người ta thường tiến
hành gây nhiễm thực nghiệm (in vivo) trên da một số động vật như thỏ, chuột lang,
chuột nhắt trắng.

một số nấm gây bệnh hệ thống như Candida albicans, Aspergillus, Histoplasma
capsulatum…. Với nấm da việc ứng dụng các phản ứng miễn dịch để chẩn đoán
còn hạn chế do tính đặc hiệu thấp. Theo một số tác giả, bằng thực nghiệm trên
động vật thấy kháng nguyên của các loài nấm da ít tính đặc hiệu, không có tính
đặc hiệu loài mà chỉ có tính đặc hiệu chi. Phương pháp thường được sử dụng là
phương pháp khuếch tán miễn dịch và điện di miễn dịch.
* Chuẩn bị kháng nguyên và kháng thể:
+ Điều chế kháng nguyên (antigen) của nấm da:
- Thành phần môi trường nuôi cấy:
Glucoza 20 gam.
Pepton 10 gam.
Nước cất vừa đủ 1000 ml.
Tiệt trùng bằng nhiệt độ 120
0
C trong 10 phút, để nguội.
- Dùng que cấy cấy nấm muốn kiểm tra vào các bình nón có chứa môi trường
trên, đặt vào tủ ấm 24-26
0
C, để trong 2-3 tuần. Nấm sẽ phát triển tạo thành một
lớp váng dày, lọc lấy các sợi nấm, dịch lọc bỏ đi.
- Đặt các sợi nấm vào từng cốc riêng, để ở nhiệt độ âm (-15 đến -20
0
C) để tạo
thành băng sau 24 giờ.
- Đặt ở nhiệt độ phòng cho đến khi băng tan hết, đem nghiền nhỏ trong dung
dịch nước muối sinh lý bằng máy Êtaminia (máy nghiền làm đồng nhất).
- Đem hỗn dịch được nghiền nhỏ để phá thành tế bào bằng máy siêu âm
(MSE) trong 25-30 phút.
- Để yên ở 4
0