1

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học là sự ứng dụng tổng hợp của sinh hóa học, vi sinh vật học và
các khoa học về công nghệ để đạt đến sự ứng dụng công nghiệp các năng lực của vi sinh
vật, của các tế bào, các tổ chức nuôi cấy và các thành phần của chúng.
Công nghệ sinh học như một thân cây mà những rễ chính của cây này là vi sinh
vật học, di truyền học, sinh hóa học, điện tử học, nông học, công nghệ học…và trên vòm
lá với hàng nghìn quả đó là các loại sản phẩm phục vụ trồng trọt, chăn nuôi, y học, năng
lượng mới, vật liệu mới, tuyển khoáng, bảo vệ môi trường
Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền, người ta có thể tạo ra được những giống cây
trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu bệnh, hạn hán và
điều kiện nghèo phân bón. Nhờ bỏ qua được việc lai chéo và khắc phục được sự tương
khắc sinh sản mà việc lai tạo giống rút ngắn được nhiều thời gian. Kỹ thuật tái tổ hợp
AND và các kỹ thuật in vitro mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa
dạng di truyền.
Đối với các loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô đã đem
lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt.
Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách
rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh
tế cao.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng, được
ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế. Ý thức được triển vọng to lớn của ngành khoa
học hiện đại này, chúng tôi xin giới thiệu quyển sách công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực
vật nhằm phục vụ sinh viên, học viên sau đại học và các cơ quan có liên quan .
Nội dung cuốn sách bao hàm toàn bộ những vấn đề cơ bản trong nội dung công
nghệ nuôi cấy mô th
ực vật.
Chúng tôi xin cảm ơn GS. Trần Văn Minh đã cung cấp cho chúng tôi nhiều tài

cấy và các thành phần của chúng.” Đến nay, định nghĩa về công nghệ sinh học được nhiều nhà khoa
học cũng như nhiều nước trên thế giới thống nhất như sau: Công nghệ sinh học là các quá
trình sản xuất ở quy mô công nghiệp có sự tham gia của các tác nhân sinh học (ở mức độ
cơ thể, tế bào hoặc dưới tế bào) dựa trên các thành tựu tổng hợp của nhiều bộ môn khoa
học, phục vụ cho việc tăng của cải vật chất của xã hội và bảo vệ lợi ích của con người.
Theo quan điểm hiện đại, các tác nhân sinh học tham gia vào quá trình sản xuất ở trên là những giống sinh vật
mới hoặc các sản phẩm của chúng được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền hiện đại (công nghệ gen).
Từ định nghĩa cô đọng này có thể thấy:
+ Công nghệ sinh học không phải là một bộ môn khoa học như toán, lý, hoá, sinh học phân tử mà là một
phạm trù sản xuất.
3

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
+ Công nghệ sinh học không chỉ tạo ra thêm của cải vật chất, mà còn hướng vào việc bảo vệ và tăng cường
chất lượng cuộc sống con người.
+ Thực tế, công nghệ sinh học mang tính ứng dụng, tuy nhiên hàng loạt kỹ thuật
của công nghệ sinh học đang là những công cụ sắc bén để nghiên cứu khoa học sinh học
và làm sáng tỏ các cơ chế của các hiện tượng sống ở mức phân tử.
ở nước ta, theo Nghị định số 18/CP của Chính phủ ngày 11/3/1994 về phát triển công
nghệ sinh học thì: “Công nghệ sinh học là một tập hợp các ngành khoa học (sinh học
phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học và công nghệ học) nhằm tạo ra các
công nghệ khai thác ở quy mô công nghiệp các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực
vật và động vật.”
- Khái niệm về công nghệ sinh học nông nghiệp (Agriculture Biotechnology)
Theo Nghị định số 18/CP của Chính phủ ngày 11/3/1994 về phát triển công nghệ
sinh học ở Việt nam thì: “Công nghệ sinh học là một tập hợp các ngành khoa học (sinh
học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học và công nghệ học) nhằm tạo ra
các công nghệ khai thác ở quy mô công nghiệp các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào
thực vật và động vật.” Vậy, “Công nghệ sinh học nông nghiệp là một tập hợp các ngành
khoa học (sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hoá học và công nghệ

hoặc hạt phấn, sau đó lưỡng bội hoá và tạo thành dòng đồng hợp tử. Kĩ thuật này đã
thành công nhiều ở những cây họ cà.
- Khắc phục lai xa bằng cách thụ phấn trong ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi cấy
phôi: Nhờ nuôi cấy trong ống nghiệm đã khắc phục tính bất hợp giao tử trước và sau khi
thụ tinh đối với lai giữa các cây khác nhau khá xa về mặt di truyền.
- Lai vô tính còn gọi là dung nạp tế bào trần (Protoplast): Nhờ kĩ thuật nuôi cấy
mô tế bào thực vật mà người ta đã tạo thành cây lai từ 2 giống khác nhau khá xa về mặt
di truyền bằng cách dùng các enzim để hoà tan màng tế bào rồi cho các tế bào trần
(không còn màng) vào nuôi cấy chung trong môi trường nhân tạo và chúng phát triển
thành khối mô sẹo (callus), từ đó chuyển khối callus này sang các môi trường phân hoá
chức năng tế bào và để nuôi cấy thành cây lai.
- Tạo giống cây trồng mới bằng kĩ thuật chuyển gen: Trên cơ sở xác định được
tính trạng quý mà gen quy định, người ta có thể chuyển những gen đó vào những cây
trồng khác với mong muốn tạo được những giống mới mang đặc tính mong muốn.
1.2. Sơ lược lịch sử phát triển
Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra
khái niệm "tế bào - Cell". Anton Van Leuwen Hoek (1632-1723) thiết kế kính hiển vi
khuyếch đại được 270 lần, lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn, tế bào tinh trùng trong
tinh dịch người và động vật. Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề
xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào:
+ Mọi cơ thể sống được cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào.
+ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ
nhất của sự sống.
+ Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào tồn tại trước đó.
Năm 1875, Oscar Hertwig chứng minh bằng quan sát trên kính hiển vi rằng sự thụ
thai là do sự hợp nhất của nhân tinh trùng và nhân trứng. Sau đó, Hermann P., Schneider
F.A và Butschli O. đã mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào. Năm 1883, Wilhelm
Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ quan sinh dục. Từ một tế bào thực
vật nuôi cấy in vitro có thể tái sinh thành một cơ thể sống hoàn chỉnh. Khả năng này của
5

ra số lượng lớn t
ế bào trần. Kỹ thuật này sau đó đã được hoàn thiện để tách nuôi tế bào
trần ở nhiều cây trồng khác nhau. Năm 1971, Takebe và cs đã tái sinh được cây từ tế bào
trần mô thịt lá (mesophill cell) ở thuốc lá. Năm 1972, Carlson và cs lần đầu tiên thực
hiện lai tế bào sôma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc
lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii. Năm 1978, Melchers và cs tạo được cây lai soma
"Cà chua Thuốc lá" bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này. Đến nay, việc tái sinh cây hoàn
chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần đã thành công ở nhiều loài thực vật.
6

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn
bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura. Kỹ thuật này sau đó đã được nhiều tác giả
phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng đơn bội (1x), dòng thuần nhị bội kép (2x),
cố định ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 để tạo giống thuần
mang tính trạng ưu thế lai).
Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật quy
mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm. Năm 1977, Noguchi và cs đã nuôi cấy tế bào thuốc
lá trong bioreactor dung tích lớn 20,000 lít. Năm 1978, Tabata và cs đã nuôi tế bào cây
thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin. Họ đã chọn lọc được dòng tế bào
cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn. Năm 1985, Flores và Filner lần
đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi r
ễ tơ ở Hyoscyamus muticus. Những
rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên. Hiện nay, công nghệ nuôi
cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong các bioreactor dung tích lớn đã được
thương mại hoá ở mức công nghiệp để sản xuất sinh dược.
Năm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra rất phổ biến trong nuôi cấy mô
và tế bào với phổ biến dị và tần số
biến dị cao, Larkin và Scowcroft đã đưa ra thuật ngữ
"biến dị dòng soma" (Somaclonal Variation) để chỉ các thay đổi di truyền tính trạng xảy

thành công. Haberlandt G., Sitzungsber Akad. Wiss. Wien, Math Naturwiss.
Kl., 111: 69-92.
1904 Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải
Crucifers. Hannig B., Bot. Zeitung, 62: 45-80.
1922 Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro. Knudson L., Bot. Gaz., 73: 1-25.
1924 Hình thành callus từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic. Blumenthal F. and
Meyer P. Z. Krebsforsch. 21: 250-252.
1925 Làm hạt phong lan nảy mầm in vitro. Knudson L., Bot. Gaz., 29: 345-379.
1929 Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà hợp khi lai ở
Linum spp. Laibach F., J Hered., 20: 201-208.
1934 White đã thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài. White P.
R., Plant Physiol., 9: 585-600.
1934 Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hoocmon thực vật đầu tiên
có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Kogl F. et al., Z.
Physiol. Chem., 228: 90-103.
1936 Nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau. LaRue C. R., Bull. Torrey Bot.
Club, 63: 365-382
1939 Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong
thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá. Gautheret R. J.,
C. R. Acad. Sci. (Paris), 208: 118-120; Nobecourt P., C. R. Soc. Biol. (Paris),
130: 1270-1271; White P. R., Am. J. Bot., 26: 59-64.
1941 Overbeek và cs đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cà rốt. Overbeek
8

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
J. van et al., Science, 94: 350-351.
1942 Gautheret lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong
nuôi cấy mô sẹo thực vật. Gautheret R. J. Bull. Soc. Chim. Biol. 41: 13
4
4 Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy mô thuốc lá in

Phytomorph., 7: 138-149.
1958 Maheshwari thực hiện nuôi cấy noãn tách rời in vitro ở cây anh túc Papaver
somniferum. Maheshwari N., Science, 127: 342.
58 Maheshwari đã tái sinh thành công phôi soma từ phôi tâm (nucella) trong nuôi
cấy noãn Citrus. Maheshwari P. and Rangaswamy N. S., Ind. J. Hort., 15: 275-
281.
1959 Tulecke và Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật quy mô lớn (134 L)
bằng nuôi cấy chìm. Tulecke W. and Nickell L. G., Science, 130: 863-864.
1959 Reinert và Steward lần đầu tiên tạo được phôi vô tính từ nuôi cấy mô cà rốt.
1960 Kanta lần đầu tiên thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm ở Papaver rhoeas. Kanta
K., Nature, 188: 683-684.
1960 Cocking lần đầu tiên đã sử dụng enzym phân giải thành tế bào để tạo ra số lượng
lớn tế bào trần. Cocking E. C., Nature, 187: 927-929.
1960 Morel lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng để nhân
nhanh phong lan. Morel G., Am. Orchid Soc. Bull., 29: 495-497.
1962 Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật- môi
trường MS. Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant., 15: 473-497.
1964 Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi
cấy bao phấn của cây cà rốt. Guha S. and Maheshwari S. C., Nature, 204: 497
and Nature, 212: 97-98 (1966).
1967 Bourgin và Nitsch tạo cây đơn bội từ hạt phấn thuốc lá. Bourgin J. P. and Nitsch
J. P., Ann. Physiol. Veg., 9: 377-382 & 10: 69-81.
1969 Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế
bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus
gracilis. Ericksson T. and Jonassen K., Planta, 89: 85-89
1970 Chon lọc đột biến sinh hoá ở thuốc lá. Carlson P. S., Science, 168: 487-489.
1971 Takebe và cs đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá. Takebe I.
et al., Naturewiss., 58: 318-320.
1972 Carlson và cs tạo được cây từ lai xa tế bào trần đầu tiên nhờ dung hợp tế bào
trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii. Carlson P. S. et al., P.

1981 Larkin và Scowcroft đưa ra thuật ngữ "biến dị soma" để chỉ các thay đổi di
truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in vitro. Larkin P. J. and
Scowcroft W. R., Theor. Appl. Gen., 60: 197-214.
1982 Krens đã chyển DNA vào tế bào trần. Krens F. A. et al., Nature, 296: 72-74.
11

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
1982 Zimmerman sử dụng kỹ thuật xung điện trong dung hợp tế bào trần.
Zimmermann U., Biochim. Biophys. Acta, 694: 227-277.
1983 Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên
quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp. Mitsui
Petrochemicals.
1983 Zambryski và cs thiết kế các vector chuyển gen thông qua Agrobacterium.
Zambryski P. et al., EMBO J., 2: 2143-2150.
1984 Chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá Nicotiana bằng ADN plasmid và tái sinh
cây chuyển gen. Paszkowski J. et al., EMBO J., 3: 2717-2722.
1985 Fraley và cs thiết kế vector Ti plasmid đã loại bỏ các gen độc gây hại cho việc
chuyển gen vào thực vật. Fraley R. T. et al., Bio/Technol., 3: 629-635.
1985 Horsch và cs chuyển gen vào mảnh lá bằng Agrobacterium tumefaciens và tái
sinh cây chuyển gen. Horsch R. B. et al., Science, 227: 1229-1231.
1985 An và cs đã phát triển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật. An G. et al.,
EMBO J., 4: 277-284.
1985 Chuyển gen vào tế bào trần cây một lá mầm và hai lá mầm bằng phương pháp
điện thẩm. Fromm M. E., P. N. A. S. (USA), 82: 5824-5828.
1985 Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở
Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn
cây tự nhiên. Flores H. E. and Filner P., Primary & Secondary Metabolism of
Plant Cell Cultures. Springer Verlag, (Eds. Neumann K. H., Barz W. and
Reinhard E.): 174-186.
1986 Crossway và cs chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá bằng vi tiêm AND trực tiếp.

là cây lùn. Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn. Từ
các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy thành công phôi cây lan
trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không
thể phát triển thành protocom.
Raghavan ( 1976, 7980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng
và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng ( tiền phôi) cần có các chất điều hoà sinh trưởng để
phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hoà sinh
trưởng.
Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều
trường hợp thì đường sucrose cho kết qủa tốt hơn các đường khác. Ngoài ra một s
ố chất
tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong
nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA
3
, auxin, cytokinine thường được
13

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Auxin thường dùng ở nồng độ thấp. Kinetin có vai trò
đặc biệt cho sự phát triển của phôi.
Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của
phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát
triển tự nhiên.
1.3.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông đ
ã
chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi. Lon và
Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấy khi nuôi các bộ
phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn.
Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng

14

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
những năm 1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên 30 loại cây. Kết
quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây
đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp
hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan.

Hình 1.1 Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
A. Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B)Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp. (C)
Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E)Tái sinh cây từ C. roseus callus. (F)
Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana. (H) Phôi vô tính
của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum.
1.3.5. Nuôi cấy tế bào đơn
Ngoài khả năng nuôi cấy các c
ơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách
và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy tế bào đơn
được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX.
Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzym. Mỗi lọai
cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau.
Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh
hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hoá
của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.
15

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.3.6. Nuôi cấy protoplast
Nuôi cấy protoplats được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960). Ông là người
đầu tiên dùng enzym để thuỷ phân thành tế bào và tách được protoplast từ tế bào rễ cà
chua. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân